吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定
吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书 微量法
吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4105规格：100T/48S产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入5mL蒸馏水备用。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入3mL蒸馏水备用。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。
临用前加入5.71mL50%乙醇（乙醇（V）：HO（V）=1：1）溶解备用。
2可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入15mL试剂四溶解。
O（V）标准品：粉剂×1支，-20℃保存，10mg吲哚乙酸。
临用前加入1.14mL50%乙醇（乙醇（V）：H2=1：1）溶解制成50μmol/mL的标准溶液。
可分装后-20℃保存。
产品说明：吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。
IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。
作用生成红色产物，在530nm下有最大吸收峰。
酶活力的大小可用破坏IAA IAA在无机酸条件下与FeCl3的速率表示。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
测定操作：1、样本处理：第1页，共3页（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
12000g4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。
12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2、操作步骤：（1）可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至530nm。
吲哚乙酸(IAA)检测
吲哚乙酸（IAA）检测
吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），又称为吲哚-3-乙酸，属于吲哚类化合物，是一种植物内源生长素，广泛分布于多种植物体内。
此外，生长素（Auxin）是最早被发现的植物激素，其化学本质是吲哚乙酸，因而习惯上常把吲哚乙酸作为生长素的同义词。
吲哚乙酸及其分子结构式
迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱质谱联用(HPLC-MS或LC-MS/MS)的方法，可检测各类植物和土壤样品中吲哚乙酸含量变化。
此外，我们还提供其他植物激素检测服务，以及植物激素系列检测试剂盒产品，以满足您的不同需求。
样品制备
吲哚乙酸提取方法（此部分涉及到公司的核心工艺，以下提供常规的提取工艺）
1）称量约0.5 g的新鲜植物样品；
2）液氮研磨至粉碎；
3）加入5 mL异丙醇/盐酸缓冲液，4℃震荡30 min；
4）加入10 mL二氯甲烷，4℃震荡30 min；
5）4℃，13000 rpm离心5 min，取下层有机相；
6）避光，氮气吹干有机相，用250 μL-500 μL甲醇(0.1%甲酸)溶解；
7）0.45 μm的微孔滤膜过滤，用HPLC-MS/MS检测。
HPLC和LC-MS测定吲哚乙酸样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目报告
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 吲哚乙酸含量信息
相关服务
植物激素HPLC检测植物激素LC-MS检测。
植物(plant)吲哚乙酸(iaa)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断植物（Plant）吲哚乙酸（IAA）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被吲哚乙酸（IAA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的吲哚乙酸（IAA）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。
4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
上海笃玛生物科技有限公司试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48pmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
吲哚乙酸氧化酶活性测定
吲哚乙酸氧化酶活性的测定一实验原理吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。
生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。
IAA氧化酶是一种含Fe的血红蛋白，以二价锰离子和一元酚为辅因子。
降解产物包括CO2和3-亚甲基羟吲哚等。
酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即：IAA氧化酶活力= IAA减少的速率。
在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。
该物质在530nm处有最大光吸收峰。
二实验材料与试剂1、材料：玉米幼苗的胚根、胚芽。
2、试剂：20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)，(使用前混合，避光保存）。
三实验步骤1、提取IAA氧化酶：称取0.3g玉米幼苗的胚根、胚芽，加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）1.5mL，冰浴研磨，4000rpm离心10分钟，取上清液，即为粗酶液。
2、IAA氧化酶与IAA的反应：两管分别混匀，25 ℃水浴保温30min。
3、IAA氧化酶活性测定混合试剂B：0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50)30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按表加入反应液或对照溶液各2mL 。
2支试管于40 ℃下保温30min，使反应液呈红色。
530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。
4、制作标准曲线：同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL另取7支试管，每支加入试剂B 2mL，再按表加入IAA的梯度浓度溶液各1mL 。
以0管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。
5、结果计算：以0~6管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA浓度。
IAA氧化酶活性（ugIAA/g FW.h) =(C对照-C实验)*V T*V/W.t.V1VT：酶液总体积（即上清液体积）；V：步骤2所得反应液体积（即5ml）；V1：反应所用酶液体积（即1ml）。
植物吲哚乙酸(IAA)酶联免疫分析(ELISA)
植物吲哚乙酸（IAA）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中吲哚乙酸（IAA）含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物吲哚乙酸（IAA）水平。
用纯化的植物吲哚乙酸（IAA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物吲哚乙酸（IAA），再与HRP标记的植物吲哚乙酸（IAA）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的植物吲哚乙酸（IAA）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物吲哚乙酸（IAA）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：3600pmol/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存标本要求：1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒（IAA比色法）
吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒（IAA比色法）吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)简介：植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸(IAA)是植物体内普遍存在的一种生长素，植物体内IAA的含量，对于植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。
植物体内存在吲哚乙酸氧化酶(Indoleacetic acid oxida-se)，该酶是植物体内一种氧化分解吲哚乙酸的酶，吲哚乙酸氧化酶能够氧化IAA使其失去活性，从而调节体内IAA的水平，影响植物的生长。
Leagene吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)检测原理是吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下形成吲哚醛，使体系中吲哚乙酸含量减少，剩余的吲哚乙酸在无机酸存在下与FeCl3作用生成红色螯合物，吲哚乙酸氧化酶活性的大小可以用其破坏吲哚乙酸的速度表示。
通过比色法(分光光度计)测定吸光度，根据对照与待测样品中吲哚乙酸含量的差值，计算出吲哚乙酸氧化酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中吲哚乙酸氧化酶活性，尤其适用于定量测定植物样本吲哚乙酸氧化酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、恒温箱或水浴锅2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、浓硫酸6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE051350TStorage试剂(A):IAA标准(200μg/ml)25ml4℃避光试剂(B):IAA Lysis buffer250ml RT试剂(C):IAA Assay buffer60ml4℃避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：将大豆或绿豆等种子置于30℃中避光萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶和根，留下胚轴作为材料。
取胚轴，称重，按每100mg加入适量预冷的IAA Lysis buffer的比例，冰浴情况下充分匀浆或研磨。
离心,留取上清液即为吲哚乙酸氧化酶粗提液。
短期4℃保存待用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，保存，用于吲哚乙酸氧化酶的检测。
吲哚乙酸实验报告
一、实验目的1. 了解吲哚乙酸氧化酶（Indole-3-acetic acid oxidase，IAAO）的基本性质和功能。
2. 掌握吲哚乙酸氧化酶活性的测定方法，包括样品制备、比色法测定吲哚乙酸含量等。
3. 分析不同处理材料对吲哚乙酸氧化酶活性的影响。
二、实验原理吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）是植物体内的一种内源生长素，广泛参与植物生长发育、果实成熟等生理过程。
吲哚乙酸氧化酶（IAAO）是一种将吲哚乙酸氧化为吲哚乙酸醛的酶，其活性大小可通过破坏吲哚乙酸的速度表示。
本实验采用比色法测定吲哚乙酸的含量，进而计算吲哚乙酸氧化酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：不同处理材料（如不同植物品种、不同生长阶段等）的叶片。
2. 仪器：电子天平、研钵、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、比色皿等。
四、实验方法1. 样品制备（1）称取约0.5 g的新鲜植物样品，液氮研磨至粉碎。
（2）加入5 mL异丙醇/盐酸缓冲液，震荡30 min。
（3）加入10 mL二氯甲烷，震荡30 min。
（4）4℃，13,000 rpm离心5 min，取下层有机相。
（5）避光，氮气吹干有机相，用250-500 L甲醇（0.1%甲酸）溶解。
（6）0.45 μm的微孔滤膜过滤，备用。
2. 吲哚乙酸氧化酶活性的测定（1）将吲哚乙酸氧化酶酶液与底物吲哚乙酸混合，置于恒温水浴锅中。
（2）在一定时间间隔内，用分光光度计测定酶反应混合物的吸光度。
（3）根据吸光度变化计算吲哚乙酸氧化酶的活力。
五、实验结果与分析1. 不同处理材料对吲哚乙酸氧化酶活性的影响通过实验结果分析，我们可以得出以下结论：（1）不同植物品种的叶片中，吲哚乙酸氧化酶活性存在差异。
（2）不同生长阶段的叶片中，吲哚乙酸氧化酶活性存在差异。
（3）处理条件（如光照、温度、施肥等）对吲哚乙酸氧化酶活性有显著影响。
2. 吲哚乙酸氧化酶活力与吲哚乙酸含量的关系通过实验结果分析，我们可以得出以下结论：（1）吲哚乙酸氧化酶活力与吲哚乙酸含量呈正相关关系。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定一、原理
1、吲哚乙酸产品概述:
吲哚乙酸可占植物体内吲哚乙酸的50-90%，可能是生长素在植物组织中的一种储藏形式，它们经水解可以产生游离吲哚乙酸。
吲哚乙酸可刺激形成层细胞分裂;吲哚乙酸刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长;促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。
吲哚乙酸在器官和整株水平上，吲哚乙酸从幼苗到果实成熟都起作用。
吲哚乙酸控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制;当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性;当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性;吲哚乙酸造成顶端优势;延缓叶片衰老;施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落;吲哚乙酸促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。
2、试验原理:
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。
植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。
酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。
吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
二、准备仪器及药品
T6新悦型分光光度计离心机
恒温水浴锅天平
研钵试管
移液管烧杯
20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0(见附表2)。
1mmol/L2，4—二氯酚:称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。
1mmol/L氯化锰:称取MnCl?4HO 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。
22
1mmol/L吲哚乙酸:称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约
90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。
吲哚乙酸试剂A或B(任备其中之一):
试剂A:15ml 0.5mol/L FeCl3，300ml浓硫酸(比重为1.84)，500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。
用时1ml样品中加入试剂4ml。
试剂B:10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。
用时于样品中加入试剂。
试剂B较试剂A灵敏。
三、操作步骤
1(将大豆或绿豆种子于30?温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。
2(取0.5g下胚轴，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，置冰浴中研磨成匀浆。
再按100mg鲜重材料加0.5ml磷酸缓冲液的比例，用磷酸缓冲液洗涤研钵。
离心(4000r/min)10分钟，所得上清液即为粗酶液。
3(取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。
另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。
一起置于30?恒温水浴中，保温30分钟。
IAA(175ug磷酸缓冲液处理 MnCl2 2、4-二氯酶液
/mL) (pH6.0)
酚
实验组 1 1 2 1 5 对照组 1 1 2 0 6
4(吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B 4ml，摇匀，置于30?的黑暗处保温30分钟，使显色。
5(将显色后呈现红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长
530nm。
6(根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量(或从直线方程式计算反应液中吲哚乙酸IAA的残留量)。
7(从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。
以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。
8(配制浓度从0梍25μg/ml的IAA溶液，分别测得吸光度A，然后绘制标准曲线，或计算直线回归方程。