荧光和磷光解析
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
荧光与磷光的基本原理
荧光与磷光的基本原理荧光和磷光是物质光致发光过程中常见的两种现象。
它们可以被用来检测材料的性质、追踪物质在生物体内的分布，以及在科学研究和工业中扮演着至关重要的角色。
本文将讨论荧光和磷光的基本原理，以及它们的应用。
一、荧光的基本原理荧光是一种光致发光现象。
当某些物质被激发时，它们会吸收能量，并在吸收后发射光子。
这个过程可以被描述为：M +hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
其中M为物质，hυ为光子，excited state和emission分别表示激发态和发射态。
荧光在荧光检测和生物学研究中被广泛使用。
它可以用于探测药物、发现病毒、细菌和细胞，以及跟踪DNA和RNA等生物大分子。
荧光还有广泛的应用，如流式细胞仪、荧光显微镜等。
二、磷光的基本原理磷光是一种光致发光现象，与荧光相似。
它的过程可以被描述为：M + hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
在此过程中，“excited state”可以分为单重态和三重态。
单重态和三重态分别对应于分子的不同电子的自旋状态。
在很多情况下，荧光和磷光都可以同时存在。
磷光通常比荧光持久，因为在它的发生过程中，光子被释放的能量不是来自分子的振动能，而是来自分子的旋转能。
在这种情况下，分子释放出的能量被分散到周围的基体中，而不是以光子的形式释放。
因此，磷光可以从几纳秒持续到数百微秒。
三、荧光和磷光的应用荧光和磷光的应用非常广泛，从材料科学到医学和环境科学。
在材料科学中，荧光和磷光被广泛用于表面分析、光辐射测量和固体物性等方面。
在医学中，荧光和磷光能够帮助识别肿瘤和病原体，优化药物筛选和治疗方法。
在环境科学中，荧光和磷光可以用于监测水体和土壤中的有机物和无机物质的分布和迁移。
值得注意的是，荧光和磷光的应用通常需要结合化学、光学、电子学和计算机学等多个领域的知识。
例如，荧光和磷光分析需要分析样品中的存在物种和激发条件，并根据荧光和磷光的特性来选择合适的检测设备和荧光染料。
荧光和磷光
荧光和磷光荧光和磷光是一对相辅相成的光学现象。
这对现象都是由光子和原子因素造成的，荧光源可以是天然现象，也可以是人造的，而磷光则主要是人工合成的。
两种光学现象有着不同的来源和用途，但在某些方面也存在类似之处。
荧光是紫外线照射物体表面后释放的可见光，是一种自发辐射现象，可以使物体显得特别耀眼。
它的主要原理是激发态经过一段时间，从激发态向某一较低能态转变，释放出可见光。
像耀斑、流星、火星、月牙等天然现象都能够产生荧光效果，同时也可以通过有机荧光染料等进行人工合成。
此外，荧光还广泛用于衣服上的发光图案，常用的物质有荧光染料和发光粉，可以使衣服发出荧光，从而增添色彩和魅力。
磷光则是微小的化学物质由于能够激发而发出的放射性光，主要由磷原子放射出来。
它是一种计划激发态，只有在做精确控制的情况下，原子才能被激发，并发出有节律的可见光。
磷光主要用于生物学检测，如蛋白质、抗原、抗体等检测，还可以用于全息成像、光照明和能量转换等领域。
荧光和磷光的共性有：首先，它们都需要能够激发原子，以及原子经历一段时间后才能释放出特定的可见光。
其次，它们均可以适用于光学仪器和设备，提升其精度和灵敏度，帮助科学家更好地研究宇宙构成。
最后，它们都能够给人视觉上的享受，使人们觉得惊叹不已。
在总结荧光和磷光的特点之后，不难看出，它们的独特性质给科学家和大众带来令人难以置信的视觉感受，而它们的相似之处在于都是一种使得物体发出可见光的光学现象。
此外，它们也为研究宇宙的构成提供了重要的帮助，在光子学行业中发挥着重要作用。
但无论是荧光还是磷光，它们共同拥有一个重要特征，即扩大我们对宇宙的认识，引领我们进入一个更大的宇宙，探索一个新的世界。
荧光、磷光定义
荧光、磷光定义
荧光：
荧光是指某些物质吸收高能量的光（如紫外线或X射线）后，电子被激发至较高能级，在很短时间内（通常为纳秒至毫秒级别）就返回到较低能级，并在此过程中释放出能量较小、波长长于激发光的光子。
这种发光现象随激发光源的消失而迅速停止。
荧光材料的发光效率高，但寿命短，常见于荧光灯、荧光染料、荧光标记等领域。
磷光：
磷光则是另一种光致发光现象，类似于荧光，物质同样因吸收高能量的光而使电子跃迁到激发态。
然而，不同于荧光，磷光物质的电子从激发态下降至基态的过程中，会发生所谓的三重态跃迁，由于这一过程涉及到自旋禁戒效应，导致跃迁速率大大降低。
因此，即使激发光源停止后，磷光物质仍能继续发光一段时间，发光时间可以从几毫秒到几小时不等。
典型的磷光材料包括夜光粉、某些宝石（如萤石）以及某些塑料制品中的发光添加剂。
第七章 分子发光-荧光与磷光解读
激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
第二章第二节分子荧光和磷光分析法
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
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磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
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(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
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（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
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(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
分子发光分析荧光磷光
荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ lem
11
激发光谱和荧光光谱
1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定 荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F)，作F—l光谱 图称激发光谱。 从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长lex，选用 lex可得 到强度最大的荧光。 2. 荧光光谱：选择lex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记 录每一波长下的 F，作 F- l 光谱图称为荧光光谱。 荧光光谱中荧光强度最强的波长为 lem。 lex 与 lem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
42
6. 测定方法－荧光光谱的制备
①测定UV-Vis吸收光谱:分析物制成溶液，扫描获得UV-Vis光 谱。从最大吸收波长中选择λmax作为激发光波长（λex）。 ②测定荧光发射光谱 :固定激发光波长 λex(通常先试用 λmax)， 设定发射光谱范围 (通常起始波长大于 λex，再延伸 100nm左 右)，扫描获得发射光谱。从中得到最大荧光发射波长λem。
29
3). pH的影响
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光强度有较大影响， 主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡的改变。
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？ A pH＝1 B pH＝3 C pH＝13 D pH＝10
30
4). 荧光熄灭 （fluorescence quenching）
UV/Vis激发物质粒子 电子从基态跃迁到激发态 电子回到第一激发态的最低振动能级 电子回到基态，同时发射出荧光
7
2 荧光和磷光光谱
菲
8
核黄素的荧光光谱
λex = 445 nm
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一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
振动弛豫 指 在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级， 而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为 10-12s数量级。
S2
S1
振动弛豫
T1
S0 吸光1 吸光2
在同一电子能 级中，电子由 高振动能级转 至低振动能级， 而将多余的能 量以热 的形式 发出。
→
振动弛豫
一、基本原理
应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光 度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。
一、基本原理
2.2 荧光或磷光光谱曲线 如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同波长 时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃 迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动， 以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
S1
S2
T1
S0 吸光1 吸光2 荧光3 磷光指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转 移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。
一、基本原理
荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁 产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能级至基态各振 动能级间跃迁产生的。
一、基本原理
（4）取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和 荧光光谱有很大的影响。
一、基本原理
给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使荧光增强
产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单
重态与基态之间的跃迁几率增大。
吸电子基团，如-COOH、-NO、-C =O、卤素等，会减弱甚至会
S2
S1
T1
S0 吸光1 吸光2 荧光3
荧光、磷光 能级图
一、基本原理
磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三 重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最低振动 能级，有可能以系间窜跃方式转至第 一激发三重态，再经过振动驰豫，转 至其最低振动能级，由此激发态跃回 至基态时，便发射磷光，这个跃迁过 程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发 光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这 种跃迁所发射的光，在光照停止后， 仍可持续一段时间。
荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基 态中各不同能级形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各 振动能级的分布情况。
基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布 情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为 相似。 由基态最低振动能级跃迁到 第一电子激发态各个振动能级的 吸收过程中，振动能级越高，两个能级之间的能量差越大， 即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
磷光的量子产率与此类似
一、基本原理
2. 荧光与有机化合物的结构 （1）跃迁类型 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
一、基本原理
激发：或n（非键电子轨道） 发射：或n跃迁
跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比 n大100-1000倍） 跃迁的寿命约为10-7—10-9s，比n跃 迁的寿命10-5—10-7s 跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的 速率常数也较小（S1T1能级差较大）
各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及 激发时的物理和化学环境等因素有关。
一、基本原理
下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说 明各种能量传递方式在其中所起的作用。 设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ 1和 λ 2的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2 及第一单重态S1。
一、基本原理
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生
1.1 电子由基态跃迁激发态
S = 2Ssi + 1
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生
1.1 电子由基态跃迁激发态 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中 一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上， 也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选 律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。 单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态 具有较低能级。
第二章
荧光光谱与磷光光谱
分子发光包括荧光、磷光、 化学发光、生物发光和散射光谱 等。
教学要求
掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱 和发射光谱特征。 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷 光）强度的影响因素。 了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。 了解磷光分析法的类型。 简介 了解荧光、磷光分析仪器的结构。
一、基本原理
（2）共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生 荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化 合物除外） 增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。例如，在多烯 结构中，ph（CH=CH）3 ph和ph（CH=CH）2 ph在苯中的荧 光效率分别为0.68和0.28。
S2 S1 T1
S0
吸光1 吸光2 荧光3
荧光
一、基本原理
系间窜跃
系间窜跃
不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种系间窜跃。 通常，发生系间窜跃时，电子 由S1的较低振动能级转移至T1 的较高振动能级处。有时，通 过热激发，有可能发生T1→S1， 然后由S1发生荧光。这是产生 延迟荧光的机理。
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 分子吸收不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子 激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及 转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激 发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个 波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能 层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波 长无关。
内转移
内转移
S2
当两个电子能级非常靠近以 至其振动能级有重叠时，常 发生电子由高能级以无辐射 跃迁方式转移至低能级。右 图中指出，处于高激发单重 态的电子，通过内转移及振 动弛豫，均回到第一激发单 重态的最低振动能级。
S1 T1
S0 吸光1
吸光2
一、基本原理
荧光发射 处于第一激发单重态中的电子 跃回至基态各振动能级时，将 得到最大波长为λ 3的荧光。注 意：基态中也有振动驰豫跃迁。 很明显，λ 3的波长较激发波长 λ 1或λ 2都长，而且不论电子开 始被激发至什么高能级，最终 将只发射出波长λ 3的荧光。荧 光的产生在10-7-10-9s内完成。
第一电子激发态的最低振动能级降落到基态各个振动能级的 荧光发射过程中，基态振动能级越高，两个能级之间的能量
差越小，荧光峰的波长越长。
也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约10-15的 短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之 间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动 能级与激发态的第二振动能级之间的跃迁几率最大，那么， 在荧光发射过程中，其相反跃迁的几率也应该最大。也就是 说，吸收和发射的能量都最大。
一、基本原理
（四）溶液的荧光（或磷光）强度
（1） 荧光强度与溶液浓度的关系
荧光强度If 正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率 If = Ia 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e
- l C)
I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 If = I0(1- 10 - l c) = I0(1- e -2.3 l c)
猝灭荧光。
一、基本原理
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低
“重原子效应”使系间跨越速率增加 （在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道 的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率）