荧光和磷光
荧光与磷光的基本原理
荧光与磷光的基本原理荧光和磷光是物质光致发光过程中常见的两种现象。
它们可以被用来检测材料的性质、追踪物质在生物体内的分布，以及在科学研究和工业中扮演着至关重要的角色。
本文将讨论荧光和磷光的基本原理，以及它们的应用。
一、荧光的基本原理荧光是一种光致发光现象。
当某些物质被激发时，它们会吸收能量，并在吸收后发射光子。
这个过程可以被描述为：M +hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
其中M为物质，hυ为光子，excited state和emission分别表示激发态和发射态。
荧光在荧光检测和生物学研究中被广泛使用。
它可以用于探测药物、发现病毒、细菌和细胞，以及跟踪DNA和RNA等生物大分子。
荧光还有广泛的应用，如流式细胞仪、荧光显微镜等。
二、磷光的基本原理磷光是一种光致发光现象，与荧光相似。
它的过程可以被描述为：M + hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
在此过程中，“excited state”可以分为单重态和三重态。
单重态和三重态分别对应于分子的不同电子的自旋状态。
在很多情况下，荧光和磷光都可以同时存在。
磷光通常比荧光持久，因为在它的发生过程中，光子被释放的能量不是来自分子的振动能，而是来自分子的旋转能。
在这种情况下，分子释放出的能量被分散到周围的基体中，而不是以光子的形式释放。
因此，磷光可以从几纳秒持续到数百微秒。
三、荧光和磷光的应用荧光和磷光的应用非常广泛，从材料科学到医学和环境科学。
在材料科学中，荧光和磷光被广泛用于表面分析、光辐射测量和固体物性等方面。
在医学中，荧光和磷光能够帮助识别肿瘤和病原体，优化药物筛选和治疗方法。
在环境科学中，荧光和磷光可以用于监测水体和土壤中的有机物和无机物质的分布和迁移。
值得注意的是，荧光和磷光的应用通常需要结合化学、光学、电子学和计算机学等多个领域的知识。
例如，荧光和磷光分析需要分析样品中的存在物种和激发条件，并根据荧光和磷光的特性来选择合适的检测设备和荧光染料。
荧光和磷光
荧光和磷光荧光和磷光是一对相辅相成的光学现象。
这对现象都是由光子和原子因素造成的，荧光源可以是天然现象，也可以是人造的，而磷光则主要是人工合成的。
两种光学现象有着不同的来源和用途，但在某些方面也存在类似之处。
荧光是紫外线照射物体表面后释放的可见光，是一种自发辐射现象，可以使物体显得特别耀眼。
它的主要原理是激发态经过一段时间，从激发态向某一较低能态转变，释放出可见光。
像耀斑、流星、火星、月牙等天然现象都能够产生荧光效果，同时也可以通过有机荧光染料等进行人工合成。
此外，荧光还广泛用于衣服上的发光图案，常用的物质有荧光染料和发光粉，可以使衣服发出荧光，从而增添色彩和魅力。
磷光则是微小的化学物质由于能够激发而发出的放射性光，主要由磷原子放射出来。
它是一种计划激发态，只有在做精确控制的情况下，原子才能被激发，并发出有节律的可见光。
磷光主要用于生物学检测，如蛋白质、抗原、抗体等检测，还可以用于全息成像、光照明和能量转换等领域。
荧光和磷光的共性有：首先，它们都需要能够激发原子，以及原子经历一段时间后才能释放出特定的可见光。
其次，它们均可以适用于光学仪器和设备，提升其精度和灵敏度，帮助科学家更好地研究宇宙构成。
最后，它们都能够给人视觉上的享受，使人们觉得惊叹不已。
在总结荧光和磷光的特点之后，不难看出，它们的独特性质给科学家和大众带来令人难以置信的视觉感受，而它们的相似之处在于都是一种使得物体发出可见光的光学现象。
此外，它们也为研究宇宙的构成提供了重要的帮助，在光子学行业中发挥着重要作用。
但无论是荧光还是磷光，它们共同拥有一个重要特征，即扩大我们对宇宙的认识，引领我们进入一个更大的宇宙，探索一个新的世界。
荧光、磷光定义
荧光、磷光定义
荧光：
荧光是指某些物质吸收高能量的光（如紫外线或X射线）后，电子被激发至较高能级，在很短时间内（通常为纳秒至毫秒级别）就返回到较低能级，并在此过程中释放出能量较小、波长长于激发光的光子。
这种发光现象随激发光源的消失而迅速停止。
荧光材料的发光效率高，但寿命短，常见于荧光灯、荧光染料、荧光标记等领域。
磷光：
磷光则是另一种光致发光现象，类似于荧光，物质同样因吸收高能量的光而使电子跃迁到激发态。
然而，不同于荧光，磷光物质的电子从激发态下降至基态的过程中，会发生所谓的三重态跃迁，由于这一过程涉及到自旋禁戒效应，导致跃迁速率大大降低。
因此，即使激发光源停止后，磷光物质仍能继续发光一段时间，发光时间可以从几毫秒到几小时不等。
典型的磷光材料包括夜光粉、某些宝石（如萤石）以及某些塑料制品中的发光添加剂。
荧光和磷光解析
一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
第七章 分子发光-荧光与磷光解读
激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
荧光和磷光
第七章分子发光分析一．教学内容1．荧光和磷光分析法的基本原理（光谱的产生、各种光谱的特征、光谱与化合物结构的关系、强度及影响因素等）2．荧光和磷光仪器3．荧光、磷光分析法的特点及大致应用4．化学发光的基本原理、发光类型、仪器及大致应用二．重点与难点1．分子的去激发过程及荧光、磷光的发射2．荧光、磷光的发射与物质结构的关系3．各种光谱的特征、区别与联系4．荧光（磷光）强度表达式的意义及影响因素三．教学要求1．基本掌握荧光和磷光发射的原理及与物质结构的关系2．了解各种光谱的绘制方法、特征与联系3．掌握强度表达式的意义、影响因素及适应性4．掌握荧光、磷光仪器的组件、工作流程及异同点5．基本了解化学发光分析法的原理、发光类型、仪器、特点及大致应用6．了解荧光、磷光分析的大致应用第一节分子荧光和磷光分析一、基本原理（一）荧光和磷光的产生在电磁辐射基础中，已经简单地讨论过荧光及磷光的产生机理。
这里将根据分子结构理论，将进一步讨论。
处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
第七章分子发光荧光和磷光
❖ 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928Jette和 West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发
射
磷 振动弛豫 光
S0
l3 l 1 分子吸收l 2和发射l 过2 程的Jablonski能级图
非辐射能量传递过程
振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通 过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的 分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这个过程称为振动弛 豫。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠 时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的 振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10 -12 s。 内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。
?直到1852年年stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光而不是由光的漫射作用所引起的从而导入了荧光是光发射的概念他还由发荧光的矿石萤石推演而提出荧光这一术语
第七章分子发光荧光和磷光
§7.1 分子发光的基本原理
荧光和磷光
S2
S1
T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
荧光
一、基本原理
系间窜跃
不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种系间窜 跃。通常，发生系间窜跃时 ，电子由S1的较低振动能级 转移至T1的较高振动能级处 。有时，通过热激发，有可 能发生T1→S1，然后由S1发 生荧光。这是产生延迟荧光 的机理。
系间窜跃
在极稀的溶液中，当lc0.05时 If =2.3 I0 lc
当入射光强度I0 和l一定时，上式为： If = K c
较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系
一、基本原理
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响
荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基 态中各不同能级形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各 振动能级的分布情况。
基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布 情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为 相似。
由基态最低振动能级跃迁到 第一电子激发态各个振动能级的 吸收过程中，振动能级越高，两个能级之间的能量差越大， 即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃 迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动 ，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性：
（1）Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
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芳环上 取代基 吸电子基团 减弱甚至会猝灭荧光
如-COOH、-NO、-C O、卤素
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低
在重原子中，能级之间的交叉现象比 较严重，因此容易发 生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速 20 率
3. 金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能 发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由 于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。 但是，若这些化合物和金属离子形成螯 合物，随着分子的刚性增强，平面结构的 增大，常会发生荧光
32
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
应用
33
化学发光分析法
一、基本原理
A +B
→C
+ D*
D* → D + h
某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时， 发射出一定波长的光
（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物 （2）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区 （3）发光持续时间较长，反应持续进行 发光反应如果存在于生物体(萤火虫)中，称生物发光
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。 V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的 形式发出。发生
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比， 但这种线性关系只有在极稀的溶液中， 当 kbc0.05时才成立。 对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸 收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性 关系。
25
2 、影响荧光强度的环境因素
NO + O3 → NO2*
NO2* → NO2 + h
37
（2）液相化学发光
化学发光反应在液相中进行
应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态
区别
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态
11
(二 )荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(ex) 以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧 光最强的波长处测量荧光强度 即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为 纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。
发射光谱：(em)
固定激发光波长（最大） 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度 即可绘制荧光发射光谱曲线
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级 →基态， T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） 增加试样的刚性: 固体磷光法： 分子缔合物的形成： 重原子效应： 敏化磷光： 低温冷冻 吸附于固相载体（滤纸） 加入表面活性剂等 加入含重原子的物质，如银盐等 通过能量转移产生磷光
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用引起荧光强度降低的现象
激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞 碰撞猝灭荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态
静态猝灭
荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光
的络合物
溶解氧与荧光物质
类型 转入三重态的猝灭
发生电子转移反应的猝灭
猝灭剂与荧光物质
荧光物质的自猝灭
12
在荧光的产生过程中，由于存在各种形 式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的 最大发射波长都向长波方向移动，以磷光 波长的移动最多，而且它的强度也相对较 弱。
13
14
激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
8
S0 吸光1 吸光2 荧光3
辐射能量传递过程 荧光发射: 电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 得到最大波长为λ 3的荧光 由图可见，发射荧光的能量
S1 S2 T1
比>λ
1
S0 吸光1 吸光2 荧光3
荧光
9
磷光发射:
电子由基态单重态激发至第一 激发三重态的几率很小，因为这 是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最 低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经 过振动驰豫，转至其最低振动能 S0 级，由此激发态跃回至基态时， 便发射磷光，
原子吸收光谱 原子光谱 原子发射光谱 原子荧光 光谱分析法 分子吸收 分子光谱 分子发光 红外光谱 紫外可见光谱
第二章 分子发光分析
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光 磷光
2
化学发光
分子荧光分析法 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生 从分子结构理论来讨论
电子所处的能级
振动能级 转动能级
分子中电子 的能量状态
电子的多重态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的）
J=2S+1
S：为各电子自旋量子 数的代数和
大多数基态分子都处于单重态
S=1, J=3
三重态 T表示 电子在跃迁过程中伴随着
3 自旋方向的变化（自旋平行）
基态单重态S
激发态单重态S
浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未 激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭 28
二、荧光分析仪
光源
氙灯和高压汞灯
激发单色器 扫描激发光谱，选择激发波长 I0
光电倍增管
光栅
样品池
发射单色器
检测器
显示器
If
I
扫描发射光谱 消除其它光线的干扰 获得所需的荧光
两个单色器 与分光光度计的差别
两个单色器互成直角
dc/dt是分析物参加反应的速率
35
若化学发光反应是一级动力学反应则
dc A I cl t dt cl dt cl c 0 0 dt
t t
即发光总强度与被测物浓度成线性： 二、化学发光反应类型
1. 直接化学发光和间接化学发光 直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 ，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子 A + B C* + D C* C + h
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
被测物本身有荧光
直接荧光法
被测物与试剂反应后
被测物使荧光熄灭
F与物质的 浓度成正比
方法
荧光猝灭法
由荧光强度降低的强度来测定被 测物的含量 某些阴离子夺取金属络合物中金属 离子，而释放出能发荧光的配位体
间接荧光法
催化荧光法
反应速度慢，荧光微弱，难测定 31 金属离子将加速反应进行
磷光分析法
1．如何获得较强的磷光
16
1.荧光效率 它表示物质发射荧光的能力，通常用下 式表示 发荧光的分子数 f 激发分子的总数
荧光效率越高；物质发射荧光越强
f
Kf Kf
kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）
Ki
凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。 17
b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级 图
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, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的
最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
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（三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频 率(紫外-可见光）相适应的结构 （共轭双键），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的 能量之后，必须具有一定的荧光量 子产率。
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4．溶剂效应
同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度 可能有明显不同。
一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*
跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。
5 ．温度的影响
一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低， 荧光效率和荧光强度将增加 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃， 荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
激发态三重态T
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S是抗磁分子，T是顺磁分子
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢)
⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，
基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；
⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低
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2．分子内的光物理过程
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三、分子荧光分析法及其应用
1. 荧光分析方法的特点
（1）灵敏度高
（2）选择性强
（3）试样量少和方法简单 （4）提供比较多的物理参数 2、荧光定量分析的方法 标准曲线法 荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系 比较法 同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液