果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优1

果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优1 果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优化
摘要:通过野外采集样品，从中筛选出两株产酶相对较高的菌株，并对其酶学
性质进行初步研究，探索其最适生长时间，生长的环境温度，最适ph，以及最适
接种量，并设计实验方案。

第一部分前言
果胶酶是一类分解果胶物质的多种酶的总称，主要包括原果胶酶，果胶脂酶，果胶裂解酶及多聚半乳糖醛酸酶四大类，因其能有效的分解果肉组织中的果胶物质,而广泛应用于食品加工、酿酒工业等方面。

此外，果胶酶在生物制药，生物污染防治，农产品加工，饲料等其他生物大规模产业也用途广泛，因而需求量也是日益增加，由于自然界中天然果胶酶广泛存在于动、植物体内，因产量较低而难以作为大规模提取，因此，寻求高效的果胶酶生产方法也更加重要，现阶段，采用微生物发酵，并从其代谢产物中提取果胶酶方法，已应用的日加成熟，各种高产、高效的菌株纷纷被筛选出来，而广泛应用于发酵生产。

一、果胶酶产生菌
(一)果胶酶产生菌的选育
据报到，在自然界中，已知的果胶酶产生菌多达40余种，其中多数为细菌和
霉菌，还有少数的放线菌、酵母菌。

1.材料和方法:
1.1实验材料:
采集果园土壤及腐烂的柑橘、桔子、甜瓜等水果腐烂的部分。

1.2培养基:
1.2.1富集培养基: 5%的葡萄糖，0.3%酵母膏，0.5%蛋白栋。

1.2.2选择培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，果胶
0.5g，琼脂2.5g，水100ml，ph自然。

1.2.3液体培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，庶糖
0.5g，水100ml，ph自然。

1.2.4土豆斜面培养基:20%土豆，20%葡萄糖，2%琼脂，ph自然
1.3菌株筛选方法
1.3.1筛选路线:采样增殖初筛复筛保存
1.3.2筛选方法
(1)增殖培养:将采集得的土壤及水果腐烂部分用无菌水稀释，搅拌充分后，静置5分钟，取上清液10ml至于50ml富集培养液中，30?,150r/min培养2-3天。

(2)菌株初筛:取富集液进行适当稀释，并涂布于选择培养基中，30?，培养3-4天，选取菌落形态较好的平板，加入0.1%的刚果红溶液，染色30min后，菌落周围有透明圈形成的即为产果胶酶菌株，观察透明圈产生快慢及其大小。

(3)菌株复筛:选取产透明圈的菌株，于选择培养平板上接种培养连续接种4-5代后，选取最优菌株，液体培养测其酶活力。

1.4酶活力测定
1.4.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制
取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，补水至1ml加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10分钟，冷却后定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。

以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线，二次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax+b，求出吸光度与半乳糖醛酸量的关系。

1.4.2液体曲5000r/min离心取上清，
1.4.3 酶活力测定
取15ml离心管加入1%的果胶溶液0.8ml，50度预热3分钟，加酶液0.2ml，混合，50度水解10分钟，加DNS试剂3ml，混合后于沸水浴中10分钟，冷却定容至15ml，离心分离2000r 10Min,取上清10ml,空白调0，540nm下测定吸光度值。

酶活力单位计算
酶活力=(A*S*D*1000)/(0.2*10)
式中:A—测得吸光度
S—测得光吸收在标准曲线上对应的半乳糖醛酸量，mg数
D—酶液或酶粉的稀释系数
(3)酶活力单位定义:在本测定条件下，每分钟水解果胶产生1ug还原糖(以半乳糖醛酸计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。

2.结果与分析
2.1 果胶酶产生菌种的筛选结果
初步筛选获得5株菌株，分别编号为A1 A2 A3 A4 A5 通过测量曲的果胶酶活力进行复筛，结果如下图
图初步筛选五种菌株酶活力比较
其中，A1、 A2两种菌种产酶活力相对较为接近，因此将对这两种菌株进行单独比较
2.2菌株产酶条件研究
2.2.1半乳糖醛酸量与吸光度的关系,如下图
2.2.2 发酵时间对两菌株产酶影响
在自然ph，温度30?，转速150r/min，接种量相同条件下，测量两菌株随时间变化，其酶活力大小的变化，结果表明，两酶的最适发酵时间为48-60小时，此时的产酶的量和酶活力都最高，如下图:
培养时间对产酶的影响
2.2.
3.发酵温度对两菌株酶活力影响
在自然ph，转速150r/min，接种量相同条件下，培养时间2天，两类菌株酶活力随温度的变化如下图，结果表明，两菌株最适的生长温度位于28-31度，此时
果胶酶的活力最大，超过31?时，酶活力有明显下降趋势，甚至无法生长，温度过低，则酶活力较低，如下图:
培养温度对产酶的影响
2.2.4 在培养时间(48h)、培养温度(30?)。

接种量相同的条件下，转速为
150r/min，不同的ph下两种菌种产酶的活力变化，从结果可以看出，两菌株的生长最适ph为6-7之间，即为自然ph条件下，两菌株有最高产酶效益，ph过高或过低皆会使两菌株生长受抑制，甚至无法生长。

如下图:
初始 Ph对产酶影响
2.2.5 在自然ph,温度30?，转速150r/min，培养时间为96h条件下，控制接种量为平时的10%、20%、30%、40%，两种菌株的产酶效果变化，从下图可以看出，接种量位于20-30%时，酶活力达到最高，接种量过低，菌株的生长时间较
长，酶活较低，而接种量过大时，刚造成短时间积累大量次级代谢产物而影响产酶效果，如下图:
接种量对产酶的影响
3结论
3.1平板涂布法，筛选出A1 A2 A3 A4 A5五种产果胶酶的菌株，初步确定A1 A2 为产酶较高的两株菌株。

3.2对A1 A2 进行酶学性质研究发现，如下表:
A1 A2
最适生长时间48 60
(h)
最适生长温度28 31
(?)
最适ph 自然自然
最适接种量(%) 20 30
优缺点 A1生长繁殖周期较短，具快速的生A2具长的生长期，所需培养温度也长期，同时生长的外界环境易于获较高，培养条件有些难度，但产酶
得，但产酶效益较低，酶学曲线波效益较高，总体酶学曲线稳定性较
动较大，稳定性差好，具长的稳定期。

1. Ph=3.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:柠檬酸7.355g+柠檬酸钠4.41g,定容于500ml容量瓶中,
2. 0.1%半乳糖醛酸溶液:0.1g烘干的半乳糖醛酸粉末定容于100ml容量瓶中,
3. DNS试剂:3,5二硝基水杨酸10g+加NaoH16g,酒石酸甲钠
300g,500ml水定容于1L容量
瓶中,十天后使用,
4. 1%果胶:1g加适量缓冲液,热水浴50度,加热至糊状转入100ml容量瓶中,补缓冲液至
100ml,有效期3天。