病毒空斑纯化步骤
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒的分离纯化
病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。
组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。
2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。
4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。
5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。
6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。
7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。
8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。
lf_12345。
病毒空斑实验原理
病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究病毒的
感染和复制机制。
通过这种实验，我们可以了解病毒在寄主细胞中
的复制过程，从而为病毒的防治提供重要的理论基础。
下面，我们
将详细介绍病毒空斑实验的原理及其应用。
病毒空斑实验的原理主要包括以下几个步骤，制备病毒悬液、
接种寄主细胞、观察病毒感染情况。
首先，我们需要从感染病毒的
细胞中提取病毒颗粒，制备成病毒悬液。
然后，将病毒悬液接种到
寄主细胞培养物中，观察病毒在细胞中的感染情况，最终形成病毒
空斑。
通过观察病毒空斑的形成情况，我们可以推断病毒的感染能
力和复制速度，进而研究病毒的生物学特性。
病毒空斑实验在病毒学研究中具有重要的应用价值。
首先，通
过病毒空斑实验，我们可以研究不同病毒株的感染特性和复制机制，为病毒分类和鉴定提供重要依据。
其次，病毒空斑实验还可以用于
筛选抗病毒药物和研究病毒的致病机制，为病毒性疾病的防治提供
理论支持。
此外，病毒空斑实验还可以应用于病毒基因工程和病毒
载体的构建，为基因治疗和疫苗研发提供技术支持。
总之，病毒空斑实验是一种重要的病毒学研究技术，通过该实验可以深入了解病毒的感染和复制机制，为病毒性疾病的防治提供重要的理论基础和技术支持。
希望通过本文的介绍，读者对病毒空斑实验的原理和应用有所了解，为病毒学研究和病毒性疾病的防治做出贡献。
病毒蚀斑技术
病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
病毒空斑纯化步骤
猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。
(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。
(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。
(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。
(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。
(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
主要问题：1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。
48h之后有些孔的细胞基本上看不清了，但是这都不是病毒造成的。
（支原体的存在会不会导致这种情况）2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层琼脂糖层？3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。
看不出明显的染色区域，只是有些红色的点点。
5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。
就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。
6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。
7、8、（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）9、。
病毒空斑纯化
病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。
在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。
但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。
凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。
蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。
此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。
若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。
试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。
对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。
蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。
有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。
而MgCl2的加强作用最强。
流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。
空斑实验简介
3、空斑纯化3.1病毒TCID501）在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。
2）将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。
3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6）结果的计算，按Reed-Muench法。
Reed-Muench法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
3.2中性红溶液和DMEM营养琼脂的配制（1）中性红溶液的配制1）取中性红1g、NaCl 8.5g溶于1L超纯水中2）高压灭菌后分装保存于4℃冰箱中。
（2）DMEM营养琼脂的配制1）取2g琼脂糖于100ml超纯水中，微波炉中火2min溶解后摇匀，高压灭菌。
2）取小牛血清4ml、中性红3.3ml无菌操作加到100ml双倍DMEM中，37℃水浴30min，摇晃均匀。
3）溶解的2%琼脂置于44℃水浴30min，与双倍DMEM混合液混合后，置于44℃待用。
3.3铺6六孔板(1) 将已准备好的V ero细胞消化均匀铺于6孔板中。
(2)细胞长成单层后吸去培养液，每孔加2ml无血清维持液置于37℃1h。
(3)将病毒用无血清维持液做10倍递增稀释。
(4)吸去孔内维持液，按合适稀释度每孔滴加200μl稀释好的病毒液, 每个稀释度加两个孔，置37℃吸附1小时后弃病毒液。
空斑实验
问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教答：1、我是这么做的：24孔板VERO，HSV11）24孔板预板2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次3）接种病毒液0.1ml/孔4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养6）3天后，吸弃培养基7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml 蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。
最终浓度为5%做出的效果很好。
不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。
染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。
问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。
甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。
简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。
因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。
然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。
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猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案
(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。
(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。
(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。
(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。
(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。
(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
主要问题：
1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。
48h之后有些孔的细胞基本上看
不清了，但是这都不是病毒造成的。
（支原体的存在会不会导致这种情况）
2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层
琼脂糖层？
3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？
4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。
看不出明显的染色
区域，只是有些红色的点点。
5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。
就是不知道自己配制的液会
不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。
6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬
斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。