CRISPR技术操作指南
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
CRISPR Cas9 系统操作详细说明及具体步骤
CRISPR/Cas9 系统操作详细说明及具体步骤CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍CRISPR/Cas9 系统操作。
质粒介绍我们使用的是Feng Zhang 实验室的系统的pX330 质粒，如下图所示：酶切系统37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。
Elute 到50 mL H2O。
我们利用BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加CIP 处理。
Target 设计Target 设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到NGG（N 代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt 即可（如上图）。
目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全KO 一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas 系统诱导产生indel）。
所以我们一般选择距离起始密码子ATG 下游200bp 范围内的exon 区域。
另外，通常一个基因往往会转录成2 个以上的isoforms，所以请选择尽量靠近5』端的公共部分，保证每个isoform 都会成功移码突变通常情况下，为了便于下游KO mutants 的鉴定，我们往往可以作如上设计：即Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp 内酶切位点唯一。
为了减少Off-Target 效应，请把设计好的Target 放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。
20 nt 确定之后，请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo 即可。
请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。
克隆构建Validate target 的编辑效率单克隆的挑取单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）（CHO、293T、HeLa、MEF 等细胞系推荐使用）。
如果编辑效率50%，推荐分两块plate 即可，最终拿到20-30 个单克隆一般可以得到成功KO 的细胞系；或者铺到100 mm dish 里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如SV589 等，但是挑取的单克隆往往不纯，有时需要重新亚克隆）。
CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明
CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明实验材料与方法一、细胞培养人宫颈癌细胞 HeLa，常规培养使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基 ( 含 1.5 mg/L-Glutamine,100 U/mL Penicillin,100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。
二、基因信息及双 gRNA 设计基因信息及分析1.hsa-mir-152 基因信息：pubmed2.hsa-mir-152 基因位于蛋白编码基因 COPZ2 内含子内，敲除hsa-mir-152 基因不会影响该蛋白编码3.hsa-mir-152 precursor 序列（87 bp）：TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCGGAAGGACC双 gRNA 设计使用在线 gRNA 设计软件在 hsa-mir-152 precursor 基因组序列两侧设计双 gRNA注：dgRNA 即为双 gRNA.三、慢病毒侵染实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hank’s SolutionTrypsin-EDTA Solution96 孔板24 孔板Lentivirus- 病毒液（GenePharma）步骤靶细胞侵染实验1.靶细胞铺板：24-well，加入2.5×105 cells/well（根据细胞种类调整），0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；2.稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度 5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按 1:9 加入到稀释液中；3.移去 Step1 中细胞培养液，加入 Step2 稀释后的病毒液，同时建立对照（blank、negative），37℃，5% CO2 过夜；4.12~24 小时移去细胞侵染后的病毒液，加入 0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；5.根据细胞状态和类型，如果必要分出 1/3~1/5，加入0.5 mL 完全培养基，继续培养 24~48 小时，荧光倒置显微镜下观察结果。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项基因编辑技术是一种快速、高效修改生物体基因组的方法，近年来取得了显著的进展。
其中，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于基因组编辑领域，成为一种常用的工具。
本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法和相关的注意事项。
CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过RNA引导的Cas9蛋白复合物识别特定DNA序列，并将其切割，以实现对基因组的修改。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9的步骤和注意事项。
1. 目标序列选择与设计在使用CRISPR-Cas9进行基因组编辑之前，首先需要选择并设计一个适合的目标序列。
目标序列应具有特异性，同时应具备足够的保守性，以确保CRISPR-Cas9的高效性和准确性。
此外，目标序列还应远离重要基因或调控区域，以避免非特异性的剪切事件。
2. CRISPR RNA合成CRISPR RNA（crRNA）是一种由CRISPR序列和目标序列组成的RNA分子。
它通过碱基配对与Cas9蛋白结合，从而指导Cas9蛋白与目标DNA序列配对，并发生切割。
在合成crRNA时，需要注意避免污染和二聚体的形成。
3. Cas9蛋白表达和纯化Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的核心组成部分，它能够与crRNA形成复合物并介导DNA的切割。
在使用Cas9蛋白之前，需要将其进行表达和纯化。
选择合适的Cas9表达系统和纯化方法，确保获得高纯度的蛋白样品。
4. CRISPR-Cas9复合物形成将crRNA与Cas9蛋白复合形成CRISPR-Cas9复合物，是基因组编辑过程中的关键步骤。
将纯化的Cas9蛋白与合成的crRNA按照一定的比例混合，在适当的条件下进行复合，形成稳定的复合物。
注意事项包括避免RNase和DNA酶的污染，以及控制复合物的浓度和组装时间。
5. 细胞渗透与转染在进行基因组编辑之前，需要将CRISPR-Cas9复合物引入目标细胞内。
细胞渗透和转染是常用的方法，常用的技术包括细胞渗透剂、转染试剂、电穿孔等。
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项基因编辑技术是一种能够修改生物体基因组DNA序列的高效方法，它为生物学研究、疾病治疗和农业改良等领域带来了突破性的进展。
其中一项重要的基因编辑技术就是CRISPR-Cas9系统，它是目前最常用且最受欢迎的基因编辑工具之一。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9的操作指南与注意事项。
CRISPR-Cas9是一种借鉴自细菌免疫系统的基因编辑工具，它通过特定的引导RNA（gRNA）和Cas9酶来实现基因组的精确编辑。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9进行基因编辑的操作指南与注意事项。
1. 设计gRNA在使用CRISPR-Cas9之前，首先需要设计合适的gRNA。
gRNA是由20个碱基的引导序列和一个PAM序列组成，它能够识别需要编辑的基因组DNA序列。
设计gRNA时，需要遵循以下几点：- 选择目标位点：选择一个适当的目标位点，最好是在外显子区域或有功能影响的区域。
- 避免副作用：避免选择存在副作用的位点，如可能引发多个剪切位点或产生错配修复机制引起的小片段插入或删除。
- 考虑gRNA的特性：gRNA应具有足够的特异性和高效率的结合能力。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白一旦设计好了gRNA，就可以进行gRNA和Cas9蛋白的合成。
这可以通过基因合成技术或购买合成的gRNA和Cas9蛋白完成。
确保在实验进行前将它们充分储存和离心，以保证其质量和纯度。
3. 转染将gRNA和Cas9蛋白转染入要编辑的细胞中，通常可以选择化学转染、电转染或病毒转染等方法。
选择适当的转染方法取决于您的实验目的和细胞类型。
4. 验证突变编辑后的细胞需要进一步验证是否成功进行了基因编辑。
最常用的验证方法是利用Polymerase Chain Reaction（PCR）分析、Western blotting或Sanger测序等技术检查目标DNA是否发生了预期的突变。
确保验证过程的准确性和可靠性。
基因编辑技术的CRISPR系统使用方法与注意事项
基因编辑技术的CRISPR系统使用方法与注意事项基因编辑技术的出现带来了革命性的突破，使人们能够直接改变生物体的基因组。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统是一种常用的基因编辑工具，其高效性和精确性使其成为科学家们的首选。
首先，使用CRISPR系统进行基因编辑需要明确的步骤与注意事项。
第一步是设计sgRNA（single-guide RNA）。
sgRNA是CRISPR系统中的关键组成部分，它能够指导Cas9酶准确地定位到目标基因上。
设计sgRNA时，应选择与目标基因相匹配的区域，并确保不会与其它基因产生非特异性的配对。
此外，sgRNA还需要具有适当的长度、稳定的结构和高活性。
第二步是构建CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9复合物由Cas9酶和sgRNA组成。
Cas9酶具有切割DNA的能力，而sgRNA能够指导Cas9酶准确地定位到基因组中的特定位置。
构建CRISPR-Cas9复合物时，需确保Cas9酶与sgRNA的浓度与比例适当，以确保有效的基因编辑。
此外，还需注意保持实验条件的一致性，避免干扰实验结果。
第三步是转染CRISPR-Cas9复合物到目标细胞中。
转染是将外源DNA或RNA导入目标细胞中的过程。
目前常用的转染方法有化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染等。
选择合适的转染方法需要考虑目标细胞类型、实验目的和转染效率等因素。
第四步是筛选和验证编辑后的细胞或生物体。
基因编辑后，需要对细胞或生物体进行筛选和验证，以确认目标基因的编辑效果。
目前常用的筛选方法包括PCR、限制性酶切和测序等。
验证编辑效果的方法则要根据具体实验目的来选择，比如功能研究可以采用功能分析、荧光染色或功能性检测等方法。
在实际应用CRISPR系统进行基因编辑时，还需注意以下几点：第一，选择目标基因时要明确实验目的，选择可行且有意义的目标。
CRISPR基因编辑技术教程
01
畜禽品种改良
通过CRISPR技术改良畜禽的生长速度 、肉质品质、繁殖性能等性状，培育优 良品种。
02
03
转基因育种
将CRISPR技术与转基因技术相结合， 实现基因的精确编辑和定向转移，加 速育种进程。
04
CRISPR技术挑战与问题
脱靶效应及安全性问题
脱靶效应
CRISPR技术在基因编辑过程中，有时会 出现非特异性切割，导致基因组其他位 置的突变，即脱靶效应。这可能会引发 不可预测的基因功能变化，甚至产生安 全隐患。
通过测序等方法验证表达载体的 正确性和完整性。
转化细胞系或组织
准备细胞系或组织
选择需要编辑的细胞系或组织，并进行适当的预 处理。
转化方法选择
根据细胞类型和组织特性选择合适的转化方法， 如脂质体转染、电穿孔等。
转化效率检测
检测转化效率，确保足够数量的细胞被成功转化 。
验证基因编辑效果
DNA水平验证
通过改进Cas9蛋白的特异性，降低脱靶率，提高基因编辑 的精确度。
开发新型CRISPR系统
探索除CRISPR-Cas9外的其他CRISPR系统，如CRISPRCas12a、CRISPR-Cas13等，以提高编辑效率和特异性。
结合其他基因编辑技术
将CRISPR技术与其他基因编辑技术（如碱基编辑器、先导 编辑器）相结合，实现更高效、更精确的基因编辑。
提取转化后的细胞DNA，通过 PCR、测序等方法检测目标基
因是否被成功编辑。
RNA水平验证
提取转化后的细胞RNA，通过 RT-PCR等方法检测目标基因的 表达水平是否发生变化。
蛋白质水平验证
提取转化后的细胞蛋白质，通 过Western blot等方法检测目 标蛋白质的表达水平是否发生 变化。
生物工程中的基因编辑技术操作指南
生物工程中的基因编辑技术操作指南在当前的生物工程领域中，基因编辑技术成为了一种非常重要的工具。
它的出现可以用来编辑、修饰、甚至改变生物体的基因序列，从而实现对生物体的精确控制和改良。
本文将为您详细介绍基因编辑技术的操作指南，帮助您更好地应用于生物工程实践中。
一、CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是目前最常用的基因编辑技术之一。
它能够精确地定位到基因组上的特定位置，并对其进行修饰。
下面是CRISPR-Cas9系统的操作流程：1. 靶向序列设计：首先，根据目标生物体的基因组序列，选择一个需要编辑的特定位点。
在靶向序列的设计时，应尽量选择与其他基因没有重叠、在基因区域内部的序列。
2. sgRNA的合成：设计sgRNA（single-guide RNA），它是由一个导向序列和一个CRISPR RNA的融合序列组成。
导向序列与靶向序列互补，能够将Cas9酶引导到目标位点。
3. Cas9酶准备：纯化Cas9蛋白，并鉴定其浓度和纯度。
存储Cas9蛋白的冷藏温度要低于-20℃，防止失活。
4. RNP复合物的制备：将sgRNA与Cas9蛋白按照一定比例混合，生成RNP复合物。
混合物中的Cas9酶与sgRNA形成稳定的复合体。
5. 细胞培养与转染：将目标细胞培养至适当的密度，并进行细胞株的筛选和培养。
之后，将RNP复合物转染到细胞中，使其与细胞内部的DNA相结合。
6. 编辑效率的评估：通过PCR、测序等方法对编辑效果进行评估。
检测是否成功实现了目标位点的修饰。
二、TALEN和ZFN技术除了CRISPR-Cas9系统，TALEN（转录激活样肽核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）是另外两种常用的基因编辑技术。
它们相比于CRISPR-Cas9系统而言，操作上稍微复杂一些。
以下是TALEN 和ZFN技术的操作指南：1. 靶向序列设计：与CRISPR-Cas9系统类似，TALEN和ZFN 技术也需要设计一个靶向序列。
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CRISPR技术操作指南十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。
在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。
就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。
在这些生物基因组中的CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。
当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR 相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒完成其功能。
将CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas 酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA 片段，另外一个就是称为导向RNA （gRNA）的RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。
gRNA 也就是细菌细胞中CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与Cas 形成复合物，指导Cas 到达正确的剪切位点。
不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR 的作用机制。
近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些gRNA 分子结合的DNA 只是部分与gRNA 互补。
在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和TALENS 可能要比Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标DNA 序列。
但是ZFN 和TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENS，以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中Cas 和gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何CRISPR 我的靶标？由于CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达Cas 和gRNA）的细胞进行转染。
研究人员可以采用一种Cas 的变体，即Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割DNA （Science, 337:816-21, 2012）。
Cas9 既能切断与gRNA 结合的DNA 链，也能切断其互补链。
目前可以从Addgene 购买Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
gRNA 的长度约为80 个核苷酸，包含两个区域：gRNA 5' 端前20 个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA 上，剩余的约60 个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9 结合，并由此指导与DNA 的结合。
gRNA 与Cas9 一样，也是通过质粒表达的，从Addgene 可以购买几种这种质粒（65 美元），但是与Cas9 不同的是，我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。
我们可以设计一个编码20 个碱基，与靶标DNA 结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码gRNA 其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。
唯一的设计要求就是，gRNA 上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5' 末端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA 结合。
这是因为gRNAs 似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的DNA 片段结合最好，这种-NGG序列也就是PAM 结构（protospacer adjacent motif）。
要在靶标DNA 区域中挑选合适的20 个碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的CRISPR Design（）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp（/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiT targeter （/ZiFiT/ChoiceMenu）。
另外也可以筛选整个基因组，找到与你的靶标位点相似的其它位点。
其中只有CRISPR Design 和E-Crisp 可以预测哪些gRNA 序列特异性最强，ZiFiT 不具有这种功能。
但是由于这些预测位点周边的不确定性，研究人员仍然无法确保gRNA 的严格特异性，因此专家们通常建议检测至少3-5 个不同的gRNA。
这些序列可以通过例如Sigma Aldrich 公司，或者Integrated DNA Technologies 公司合成，每个费用大约为10-20 美元。
虽然Cas9 和gRNA 能通过各自的质粒来表达，但是研究人员也可以选择在同一个质粒中表达gRNA 和Cas9，这对于难转染的细胞来说比较合适，比如免疫细胞。
Addgene 公司也提供这种双表达质粒（价格为65 美元）。
不过为了快速地测试不同的gRNAs，研究人员可以利用PCR 构建编码gRNA 的DNA 片段，其中包含激活表达的启动子，然后将这个片段与携带Cas9 的质粒一同转染细胞。
这种方法无需克隆gRNA 表达质粒，可以节约两天时间，来自Broad研究院的张锋表示。
一旦你已经在细胞中表达了gRNA 和Cas9 酶，那么这一复合物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶标DNA 的两条链。
尽管细胞的DNA 修复机制会试图修补片段，但是由于存在一个称为非同源末端连接（nonhomologous end joining）的过程，因此往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。
这样通过靶向基因起始位点的周围区域，研究人员就能阻断几乎所有的表达。
如何检测基因编辑的效率？虽然Cas9-gRNA 复合物作用强大，但是我们可能仍然希望能直接检测下这一工具是否正确突变了靶标，或者有没有出现脱靶的现象。
这种方法与ZFN 、TALEN不同——后两者通常需要检测许多融合蛋白，从中找到编辑靶标位点的那一个，CRISPR 方法则往往是利用尝试的第一个gRNA 突变靶标，正如来自麻省总医院的病理学家Keith Joung 说的那样，他的实验室检测的约90% 的gRNAs 都完成了目的靶标的突变。
然而，Cas9-gRNA 在避免脱靶方面并不是那么可靠，去年发表的少数研究表明，一些gRNAs 出现了多达5 次错配的脱靶问题。
不过还有一些研究表明gRNAs 的特异性也很强，未曾出现过一次脱靶。
Joung 表示，虽然没有又快又好的方法来提高特异性，但我们可以挑选与潜在可能脱靶区域相似性最小的gRNAs，来进行这项研究，CRISPR Design等程序可以实现这一点。
Cas9-gRNA 工具常用于失活许多细胞中的一个兴趣基因。
研究人员可以通过证明这个基因产物无法表达，或者由于基因产物缺失而出现的某种细胞表型，来验证这个工具的作用。
为了确保这些作用不是由于突变了脱靶位点造成的，我们可以利用一种Surveyor assay 来直接分析DNA 靶标位点，预测脱靶位点。
这需要通过PCR，以及一种特殊的酶（只切割带有突变的PCR 产物）放大靶标位点，然后再将突变和未突变的DNA 片段在琼脂糖凝胶中分离开来，突变的片段会小一些，因为它们被切断过。
这种方法也可以用于构建具有所有兴趣基因相同突变的克隆细胞系，或者来自敲除小鼠的小鼠细胞，为了完成这些任务，我们可能需要确保Cas9-gRNA 复合物没有在未预测位点上引入一个突变。
对于这些实验我们可能还需要进行整个基因组的高通量测序。
如何优化gRNA 的特异性？除了挑选与非靶标位点互补性最小的gRNA 序列以外，还有两种可以减少脱靶效应的方法。
一个是转染的Cas9 和gRNA 表达质粒（或者gRNA PCR 盒）数量尽可能的少，只要满足所必需的靶活性的最低量就行。
因为这些浓度足以令靶标位点突变，就不会去突变非特异性位点，——脱靶活性通常比靶向活性要低。
另一种策略是采用Cas9 的另外一种突变版本：Cas9 nickase，这种酶只会切割结合gRNA 的那条DNA 单链。
正常的Cas9 切割的是双链，单链缺口通常细胞会修补，但是如果细胞中表达的是Cas9 nickase，以及与同一DNA 靶标结合的一对gRNAs，那么缺口上就能会出现突变。
这种方法可以降低脱靶活性，因为不太可能两个gRNAs 同时恰巧靠近脱靶位点。
不过这种方法打靶效率可能会比正常Cas9 和单个gRNA 低。
要想消除所有的脱靶效应是不可能的，因为其中许多可能出现在基因组中的任何非编码区域。
不过我们可以认为靶基因失活能引起可见的细胞效应，如果几个结合不同基因区域的gRNAs 出现了相同的表型，那么就能假定具有不同的脱靶效应，Joung 说。
通过表达质粒将基因引入细胞，恢复失活基因的表型也是一种不错的验证方法。
利用Cas9-gRNA 系统还能做什么？过去一年半的研究表明，Cas9-gRNA 系统可以用于多个方面，比如张锋实验室就利用这一系统，在细胞中同时表达了，来自不同表达质粒的5个靶向不同基因的gRNAs，以及来自一个独立表达质粒的Cas9，切割所有靶标位点。
“靶向超过5个基因也是可能的”，张锋说。
而要想利用ZFN 和TALENS 系统做到这一点，是不可想象的，因为靶向单独一个位点都要花费大量的人力物力。
除了失活基因，利用Cas9-gRNA 还可以纠正基因。
来自佐治亚理工学院的生物医学工程叫声包钢（Gang Bao，音译）正在朝着这方面努力，他尝试纠正一个破坏性的单核苷酸突变，患有镰刀状细胞贫血症的患者其β-珠蛋白基因上的两个拷贝就出现了这种突变。
研究人员利用Cas9 nickase 和一对gRNA 造成双缺口，同时将一个线性DNA 片段转染进细胞中，片段大小通常为400-800 碱基，也可以是能作为基因纠正模板的小质粒。