细菌计数
实验六 细菌计数法
实验六细菌计数法菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
目录菌落总数介绍检验方法说明（一）样品的处理和稀释：（二）倾注培养（三）计数和报告菌落总数介绍菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
三种细菌计数方法的比较
三种细菌计数方法的比较细菌计数是微生物学中一项重要的实验技术，用于确定细菌菌群的数量。
在微生物学研究、医学和食品工业等领域中，细菌计数方法的准确性和可行性非常关键。
目前，常用的三种细菌计数方法包括直接计数法、密度计数法和滴定计数法。
本文将对这三种方法进行比较，包括原理、优缺点和适用范围。
直接计数法是通过显微镜观察，直接计算视野中的细菌数量来进行计数的方法。
该方法简单快捷，不需要进行培养过程。
其中，常用的直接计数方法有暗视野法、荧光显微镜法和流式细胞术。
这些方法可以直接观察到不同形态和大小的细菌，并且可以获得准确的结果。
此外，直接计数法还可以用于测定活菌和死菌的比例，对于评估细菌的生物活性非常有用。
然而，直接计数法对设备要求较高，需要专业的显微镜和技术操作，而且适用于底浓度的细菌样本。
与直接计数法相比，密度计数法是细菌计数中常用的一种方法。
该方法通过将细菌样本适当稀释至能观察到单个菌落形成的数量范围，并在琼脂培养基上培养并计数菌落的数量来确定细菌的数量。
密度计数法的优点是适用于各种样品类型，并且可以进行定量计数。
此外，该方法还可以通过调整稀释倍数来适应不同细菌的菌落形成能力。
但是，密度计数法需要进行培养过程，时间较长，并且无法区分活菌和死菌。
滴定计数法是通过逐渐稀释细菌悬液，将其滴定到琼脂培养基上，然后通过滴定液的颜色变化或者生长的细菌落的数量来确定细菌的数量。
与密度计数法类似，滴定计数法也需要进行培养过程。
但是，滴定计数法具有简单、快捷、经济的特点。
同时，滴定计数法可以通过改变滴定液浓度来适应不同样本中细菌的菌落形成能力，并且可以计算出细菌的最概然数。
然而，滴定计数法对于有颜色的样本适用性较差，因为颜色会干扰滴定液的颜色变化。
此外，滴定计数法无法区分活菌和死菌。
综上所述，三种细菌计数方法各自有其优点和局限性。
直接计数法可以获得准确的结果，适用于底浓度的细菌样本，但要求设备和技术较为专业。
密度计数法能够进行定量计数，适用于各种样品类型，但需要进行培养过程。
细菌计数方法实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌计数的基本原理和方法。
2. 了解不同细菌计数方法的优缺点。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据处理和分析能力。
二、实验原理细菌计数是微生物学研究中的一项基本技能，常用的细菌计数方法有直接计数法、活菌计数法和间接计数法等。
本实验主要介绍平板菌落计数法（CFU法）和显微镜直接计数法。
1. 平板菌落计数法（CFU法）：将样品进行稀释，涂布在固体培养基上，培养一定时间后，根据培养皿上生长的菌落数来推算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：将样品进行稀释，用计数板或计数仪直接计数，根据计数室内的细菌数来推算样品中的细菌数量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌菌液、牛肉膏蛋白胨培养基、生理盐水、计数板、显微镜、移液器、培养箱等。
2. 实验仪器：培养皿、移液器、酒精灯、镊子、无菌操作台、培养箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿，制成平板。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用无菌镊子取适量稀释液，涂布在平板上。
（4）将平板倒置放入培养箱，培养一定时间。
（5）计算平板上生长的菌落数，根据稀释倍数计算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入计数板，制成涂片。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用移液器吸取适量稀释液，滴加在计数板的计数室上。
（4）将计数板置于显微镜下，观察计数室内的细菌数。
（5）根据计数室内的细菌数和稀释倍数计算样品中的细菌数量。
五、实验结果与分析1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）稀释倍数：10^-4（2）菌落数：30（3）样品中的细菌数量：30 × 10^4 = 3 × 10^52. 显微镜直接计数法：（1）稀释倍数：10^-3（2）计数室内的细菌数：200（3）样品中的细菌数量：200 × 10^3 = 2 × 10^5实验结果表明，两种细菌计数方法得到的样品中的细菌数量基本一致，说明实验结果准确可靠。
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法常用的细菌计数方法主要有显微镜计数法、平板计数法、膜过滤法和浑浊度法等。
下面将逐一介绍这些方法。
显微镜计数法是最基本的细菌计数方法之一、将细菌培养液取少量放在显微镜载玻片上，用显微镜观察并计数细菌个数。
这种方法需要操作技巧熟练，适用于较稀疏的细菌培养液，但不适用于高密度的细菌培养液，并且仅能得到一个粗略的细菌数量。
平板计数法是一种较为常用的细菌计数方法。
将稀释后的细菌培养液均匀涂在含有培养基的平板上，经过一段时间的培养后，可以通过数独落在平板上形成的菌落数量来估计初始细菌数量。
通常将膨胀菌落数乘以相应的稀释倍数从而得到细菌的数量。
平板计数法的优点是简单易行，适用于大量细菌的计数，但该方法只适用于能够在固体培养基上生长的细菌。
膜过滤法是一种通过滤除细菌并计数膜上细菌数量的方法。
将细菌培养液通过微孔膜过滤器，在膜上滤除细菌，然后将膜放在富含营养物的培养基上进行培养，形成菌落后进行计数。
与平板计数法相比，膜过滤法更适用于含有颗粒物的液体或空气中的细菌计数。
膜过滤法的优点是操作相对简单，适用于含有较多颗粒物或固体物质的液体的细菌计数，但该方法仅适用于能够通过过滤的培养液。
浑浊度法是一种通过测量培养液的浑浊度来估计细菌数量的方法。
利用光密度计或比色计测量细菌培养液的吸光度或浑浊度，并通过细菌密度与浑浊度之间的关系来计算细菌数量。
这种方法不需要进行涂片或过滤步骤，适用于细菌数量较多的情况。
然而，浑浊度法有一定的局限性，因为细菌的大小、形状和组成可能对浑浊度产生影响，而且需要事先建立浑浊度和细菌数量间的校准曲线。
除了以上介绍的方法，还有一些其他的细菌计数方法，如Flow cytometry（流式细胞仪）、Most probable number（最可能数）等，这些方法各有特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行细菌计数。
细菌计数方法的选择应根据实验的目的、样品性质和操作条件等因素来确定。
测定细菌数量的方法
测定细菌数量的方法细菌是一种微生物，它们广泛存在于自然界中的各种环境中，包括土壤、水体、空气以及人和动物的体内。
测定细菌数量在许多领域中都具有重要的应用，例如医学诊断、食品安全、环境监测等。
本文将介绍几种常见的测定细菌数量的方法。
1.直接计数法直接计数法是最基本的测定细菌数量的方法之一、该方法利用显微镜观察细菌悬液中的细菌数量，并通过数学方法计算出相应的浓度。
直接计数法需要专业的显微镜和显微镜计数室，比较繁琐且耗时，但是结果较为准确。
2.厌氧培养法厌氧条件下的细菌繁殖速度较慢，通常需要较长时间才能形成可见的菌落。
利用厌氧培养法可以通过观察培养基上细菌形成的菌落数量来测定细菌数量。
该方法适用于对厌氧条件下的细菌进行测定。
3.过滤法过滤法是利用特定的滤膜或滤片来筛选细菌，并将细菌附着在滤膜上。
通过将滤膜放置在含有营养成分的培养基上，细菌可以在培养基上生长。
最后，可以通过观察滤膜上的菌落数量来测定细菌数量。
过滤法适用于水样、空气样以及其他液体样品。
4.光密度法光密度法是利用细菌悬液的浑浊程度来测定细菌数量的一种方法。
当细菌繁殖增多时，细菌悬液的浑浊度也会增加。
可以使用光密度计来测量细菌悬液的浑浊度，然后通过校正曲线来计算细菌数量。
5.蛋白质测定法细菌在生长过程中会合成蛋白质。
通过检测培养液中的蛋白质含量，可以间接测定细菌数量。
该方法适用于较大规模的细菌培养，可以通过常规的蛋白质测定方法来进行测定。
6.PCR方法PCR（聚合酶链反应）是一种利用DNA复制技术来测定细菌数量的方法。
通过选择特异性的引物和荧光探针，可以选择性扩增目标细菌的DNA 并进行测定。
PCR方法具有高度的灵敏性和特异性，适用于检测特定种类的细菌。
综上所述，测定细菌数量的方法有很多种，选择合适的方法取决于实际应用的要求、样品特性以及实验条件等因素。
不同的方法各有优缺点，研究人员需要根据具体情况选择适当的方法来进行细菌数量的测定。
细菌的计数法
CFUCFU (Colony-Forming Units)经培养所得菌簇形成单位的英文缩写。
cfu:colonyformineunit,菌落形成单位，将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。
意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！传统上就叫“个”。
但是，我们知道，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。
就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。
cfu代表“colony forming units”。
cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。
但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。
目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。
另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
测定细菌总数的方法通常包括以下几种：
1. 显微镜计数法：将待测样品制成适当浓度的悬浮液，然后使用显微镜观察计数。
这种方法常用于观察对显微镜可见的大型细菌。
2. 平板计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，然后在固体培养基上均匀涂布。
经过适当时间后，可数出单个菌落的数量，并根据稀释倍数计算出细菌总数。
3. 涂布计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，通过草屑涂布或涂布棒均匀涂布在固体培养基上。
经过适当时间后，可数出涂布上细菌的总数。
4. 易液化琼脂凝胶计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，与液化琼脂凝胶混合，然后倒入琼脂凝胶平板上固化。
经过适当时间后，可数出液化琼脂凝胶上细菌的总数。
5. 流式细胞仪计数法：将待测样品进行适当稀释后，通过流式细胞仪对样品中的细菌进行单个细胞的计数和分析。
这种方法快速、准确，适用于大批量的细菌计数。
需要注意的是，不同的方法适用于不同类型的细菌和样品，选择合适的方法对准
确测定细菌总数十分重要。
此外，测定细菌总数时需要注意消毒、防止交叉感染等实验操作安全。
细菌计数——精选推荐
细菌计数细菌计数试验⽅案1 菌种葡萄球菌菌株（分离奶⽜乳房炎奶样），由本实验室筛选保藏．2 培养基平板培养基：普通营养琼脂．液体培养基：普通⾁汤．3 仪器和器具分光光度计；摇床；试管；移液器；青霉素瓶．4 ⽅法4.1 接种：将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后，在试管中加⼊10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2－3个进⾏接种，接种后37℃、震摇培养．4.2 离⼼：将液体培养的细菌部分⽆菌分装离⼼管，3000rpm离⼼10分钟，弃上清，沉淀⽤⽣理盐⽔/PBS重悬，适当调整浓度，进⾏OD 值测定；另外⼀部分液体培养细菌进⾏活菌计数⽤。
4.3 菌体最适吸收波长测定：以⽣理盐⽔/PBS做对照调零，取适当稀释浓度菌液，对其进⾏Uv波长（300-900nm）扫描测定OD值(表1)，据此确定其最⼤光吸收波长并⽤于以后各步OD值的测定．表1 细菌不同波长扫描的光吸收值波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值4.4 菌体⽣长曲线测定：取盛有10mL普通⾁汤的试管13个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。
⽤移液器分别准确吸取20µL菌液加⼊已编号的13个试管中，于37℃下振荡培养。
然后分别按对应时间将试管取出，⽴即按上述步骤离⼼，进⾏OD值测定，同时进⾏作平板计数。
(表2)4.4.1 平板计数：将每⼀时间菌液再梯度稀释(根据菌种⽽定，⼀般⾄lO-4、lO-5、lO-6、lO-7)，分别吸取0．5mL涂平板(三个平⾏)，取平均数进⾏活菌的准确计数。
4.4.2 OD值测定：将⽣理盐⽔/PBS倾倒⼊⽐⾊杯中，选⽤最适吸收波长分光光度计上调节零点，作为空⽩对照，并对不同时间培养液从0h起依次进⾏测定，对浓度⼤的菌悬液⽤⽣理盐⽔/PBS适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
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细菌计数试验方案
1 菌种
葡萄球菌菌株（分离奶牛乳房炎奶样），由本实验室筛选保藏．
2 培养基
平板培养基：普通营养琼脂．
液体培养基：普通肉汤．
3 仪器和器具
分光光度计；摇床；试管；移液器；青霉素瓶．
4 方法
4.1 接种：
将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后，在试管中加入10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2－3个进行接种，接种后37℃、震摇培养．
4.2 离心：
将液体培养的细菌部分无菌分装离心管，3000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用生理盐水/PBS重悬，适当调整浓度，进行OD值测定；另外一部分液体培养细菌进行活菌计数用。
4.3 菌体最适吸收波长测定：
以生理盐水/PBS做对照调零，取适当稀释浓度菌液，对其进行Uv波长（300-900nm）扫描测定OD值(表1)，据此确定其最大光吸收波长并用于以后各步OD值的测定．
表1 细菌不同波长扫描的光吸收值
波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值
4.4 菌体生长曲线测定：
取盛有10mL普通肉汤的试管13个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。
用移液器分别准确吸取20µL菌液加入已编号的13个试管中，于37℃下振荡培养。
然后分别按对应时间将试管取出，立即按上述步骤离心，进行OD值测定，同时进行作平板计数。
(表2)
4.4.1 平板计数：
将每一时间菌液再梯度稀释(根据菌种而定，一般至lO-4、lO-5、lO-6、lO-7)，分别吸取0．5
mL涂平板(三个平行)，取平均数进行活菌的准确计数。
4.4.2 OD值测定：
将生理盐水/PBS倾倒入比色杯中，选用最适吸收波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用生理盐水/PBS适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
表2 生长曲线光吸收测定值
时间(h) 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 OD值
活菌数
4.4.3 绘制曲线找出细菌的生长繁殖的4个时期：迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期。
4.5 利用OD值估测细菌活菌数：
根据菌体生长曲线，找出菌体对数生长期，测定在对数生长期细菌活菌数。
选对数期OD值在0.9-1之间的菌液作为原菌液样品，将此液分别作1：1.0、1：1.2、1：1.4、1：1.6、1：1.8、1：2.0六个稀释度稀释，分别测定其OD值，与此同时分别将此六个稀释度的菌液进行准确的细菌平板计数．记录OD值和相应的计数结果。
（表3）
表3 细菌或菌数与OD值关系
稀释度生理盐水1：1.0 1:1.2 1:1.4 1:1.6 1:1.8 1:2.0 OD值
活菌数
根据比耳定律，溶液的浓度过高或过低，均能影响测量结果的准确性，固此选择OD值在0.2—1之间的范围确保结果回归方程r均大于0.95．从而证明了在此光度的范围内，细菌菌液的吸光度与细菌活菌数之间呈强相关性。