细菌总RNA提取说明-生工
细菌总RNA快速抽提试剂盒
产品编号：SK8625/SK8626
包装规格：50次/100次
试剂盒组成
组分 SK8625，50次 SK8626，100次
Buffer Rlysis-B 50 ml 100 ml
DEPC-treated ddH2O 30 ml 60 ml
操作手册1份1份
保存方法及注意事项
试剂盒于常温运输，4°C保存。
有效期见包装。
产品介绍
本试剂盒是生工生物工程（上海）有限公司最新研制成功的一种细菌总RNA快速抽提试剂盒。
因为细菌RNA半衰期很短，RNA很容易发生降解。
针对这一难题，本试剂盒采用溶菌酶与裂解液Buffer Rlysis-B共同作用，快速裂解样品，再通过氯仿抽提、无水乙醇沉淀等步骤，可获得浓度高、完整性好的RNA。
适合于从各种来源的细菌（革兰氏阳性或阴性菌等）培养液中快速提取RNA。
使用本试剂盒，从1 ml对数生长期的细菌菌液中提取5~15 µg总RNA，可直接用于RT-PCR、Northern Blot、斑点杂交等实验。
本产品具有以下特点：
1. 操作简单，全过程可在40分钟内完成。
2. 完整性好，纯化的RNA几乎不会发生降解。
3. 纯度高，OD260/280一般为2.0。
试剂准备
自备试剂：无水乙醇、75%乙醇、溶菌酶、氯仿等。
标准抽提步骤
4. 取1 ml对数生长期的细菌，8,000 rpm 4°C离心1 min，彻底弃掉培养基，加100 µl溶菌酶，振荡混匀。
（G-菌使用的溶
菌酶浓度为400 µg/ml，室温酶解3~5分钟；G+菌使用的溶菌酶浓度为3 mg/ml，室温酶解5~10分钟。
）
✓收集菌体后可用500 µl DEPC-treated ddH2O漂洗一次，10,000 rpm离心1分钟，弃上清，进一步去除残留的培养基。
5. 立即加入900 µl Buffer Rlysis-B震荡混匀，室温放置3 min。
6. 向裂解样品中加入200 µl 氯仿，充分混匀。
12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清。
7. 向上清液中加入1/3 体积无水乙醇，混匀，室温放置3 min，12,000 rpm 4°C离心5 min，小心倒掉上清。
✓离心后，在离心管底部，可能无肉眼可见的沉淀产生，属正常现象，请继续以下操作。
8. 用700 µl的75%乙醇（请用DEPC-treated ddH2O配制）洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C离心3 min, 小心倒掉上清。
9. 重复步骤5一次。
10. 室温倒置10 min，尽可能使离心管中残留的乙醇彻底挥发。
加入30-50 µl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或
-70°C长期保存。
✓如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。
然后开盖室温放置5~10分钟至残留的乙
醇完全挥发。
吸取残液时注意不要将RNA沉淀取出，避免RNA损失。
【精选】Trizol法提取细菌总RNA
实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。
无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
二、主要试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；2、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。
）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；5、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清；6、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；（二）. RNA 浓度的测定取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。
一种简便高效提取细菌总DNA和RNA的方法_于源华
1． 1 细菌培养 大肠杆菌 E． Coli DH5α 由本实验室保存。用接
种环取冻存菌种于 LB 固体培养基上划线，置 37℃ 培养箱过夜培养，然后挑单菌落接种于 10 mL 的 LB 液体培养基，置 37℃ 摇床振荡培养。待菌液浓度达 OD600 = 0． 8 时，12000 rpm 离心收获菌体。
Simple and efficient method to extract bacterial total DNA and RNA
YU Yuan － hua，ZHANG Xiao
（ College of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China）
（ 1） 取 1 ～ 3 mL 菌液，12000 rpm，5 min，离心沉 淀菌体，弃上清。
（ 2） 加入 200 μL ddH2 O，吹打重悬。 （ 3） 加入 200 μL 酚 / 氯仿 （ 1 ∶ 1 ） ，涡旋混匀。 13000 rpm，2 min。 （ 4） 取上清，重复步骤（ 3） 一次。 （ 5） 取上清，加入 2 倍体积无水乙醇和 1 /10 体 积 5 M NaCl，混匀。 （ 6） 13000 rpm，5 min，弃上清，保留沉淀。该沉 淀即为细菌总 DNA 和 RNA 样品。500 μL 75% 乙 醇洗涤一次。 （ 7） 室温敞口放置 5 min 晾干，加入 20 μL ddH2 O 溶解沉淀。 1． 5 电泳
4 结论
用酚 / 氯仿（ 1 ∶ 1） 来裂解菌体，使裂解细胞和 抽提蛋白两个步骤合二为一，既节省时间，又提高效 果。并且由使提取的核酸样品较完整。
生物工程上游技术实验-生工16级
六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验五 RNA的制备和质量鉴定
一、实验目的
掌握利用试剂盒提取植物细胞总RNA的方法。
二、实验原理
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µ L）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验四 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织 中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖 凝胶电泳检测。
二、实验原理
核酸是生物体的重要成分，在细胞中常与蛋白质结合在一 起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。 在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大， RNA核蛋白的溶解度小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可 利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品 中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。
总RNA提取及其浓度、完整性测定
5.1.1.5.1总RNA提取及其浓度、完整性测定用Real-time RT-PCR方法确定鸡各肠段NaPi-IIb mRNA表达量。
用购自天根生化科技（北京）有限公司（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.）的Trizol试剂提取十二指肠、空肠和回肠总RNA。
用核酸蛋白检测仪在260nm波长处测定总RNA浓度。
用琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。
总RNA提取步骤为：（1）预处理将肠粘膜样品从超低温冰箱取出（戴医用手套），迅速打开离心管盖子（否则会在液氮中取出时突然受热膨胀而爆炸），将开盖离心管放入纱布袋，纱布袋置于液氮罐中。
（2）取样至超净工作台后，用液氮预冷研钵（研钵之前经酒精燃烧灭菌处理），并使研钵中留有液氮。
用镊子夹出纱布袋中离心管，迅速置于研钵中，用研杵砸破离心管壁，镊子夹取肠粘膜样品（约50-100mg），迅速放入组织研磨器中（研磨器置于冰上）。
（3）研磨先向玻璃研磨器中加入0.2mL Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mL离心管中；然后向玻璃研磨器内加入0.8mL Trizol溶液清洗，再全部倒入1.5mL离心管中。
颠倒混匀10下，冰上静置5min。
（4）分相向离心管中加0.2mL氯仿。
盖紧样品管盖，用力摇晃试管15s，使其充分混匀，冰上静置5min。
4℃条件下，12000g/min离心15min。
（5）沉淀将上层水相转入新1.5mL EP管中（约400-500uL），加入0.5mL 异丙醇，混匀后冰上放置15min，4℃12000g/min离心10min。
此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即RNA。
（6）洗涤小心倒掉上清液，留取沉淀。
加1mL 75%预冷乙醇，用枪头把溶液沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。
4℃条件下，7500g/min离心5min。
（7）再溶解小心倒掉上清液，离心5s。
用枪头将离心管内残留乙醇吸出。
放置超净工作台，风机吹干约1-2min。
总RNA提取实验原理
总RNA提取实验原理总RNA提取实验是一种用于从细胞或组织样品中提取总RNA（total RNA）的实验方法。
总RNA包含细胞内的所有RNA，包括mRNA（messenger RNA）、rRNA（ribosomal RNA）和tRNA（transfer RNA）等。
总RNA提取是进行分子生物学研究的重要步骤之一，它使得研究者可以获取样品中的全部RNA，并进一步应用于RNA测序、RT-PCR等实验。
1. 细胞或组织的破碎：首先将待提取的细胞或组织样品加入破碎缓冲液中，通常包含Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS等。
这些缓冲液中的成分有助于维持适宜的pH值和细胞膜的稳定性。
然后利用机械或化学方法，破坏细胞或组织的结构，以释放RNA。
例如，可通过高速离心破碎细胞，或使用离解酶（如蛋白酶K）降解维持细胞结构的蛋白质。
2.RNA的溶解：破碎后的样品中含有RNA、DNA、蛋白质和其他杂质。
为了分离RNA，需要加入盐溶液（如醋酸钠、乙酸铵等）来改变样品的离子强度，从而促进RNA的溶解。
同时，可以加入乙醇沉淀，将RNA从溶液中沉淀下来。
3.RNA的洗涤：通过多次洗涤，可以去除样品中的DNA、蛋白质和其他杂质。
洗涤时可使用乙醇、乙酸盐等具有去除杂质作用的溶液。
洗涤过程可以使用离心等方法将杂质沉淀下来，然后将上清液收集。
4.RNA的纯化：纯化步骤旨在去除残留的DNA、蛋白质和其他污染物，以获得纯净的RNA。
纯化的方法包括酚/氯仿提取法、硅胶柱提取法等。
其中，酚/氯仿法利用酚醇将DNA溶解于有机相中，而RNA则溶解于水相中。
硅胶柱提取法则依靠RNA与硅胶的亲和力差异，通过将样品通过硅胶柱，使得RNA与硅胶结合，而DNA和蛋白质则被去除。
总RNA提取实验需要注意以下几点：首先，实验室操作环境要经过彻底清洁消毒，以防止RNA的降解或污染；其次，实验中使用的试剂和仪器要保持优良的质量，以确保提取的RNA质量；另外，实验过程中要避免样品受到RNase的污染，RNase是一种常见的蛋白质酶，能够降解RNA，因此需要在RNase-free条件下进行实验。
生工RNA提取试剂盒
UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒产品编号：SK1321/SK1322包装规格：20次/100次试剂盒组成组分 SK1321，20次 SK1322，100次纯化套件（吸附柱+收集管） 20套 100套Trizol Reagent 12 ml 60 mlRPE Solution 5 ml 25 mlDEPC-treated ddH2O 1 ml 5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，试剂请按照要求分别保存。
有效期见包装。
Trizol是强腐蚀性物质，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。
沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
产品介绍该试剂盒采用Trizol提取总RNA，得到的总RNA通常不含有siRNA、 snRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和tRNAs等200 nt以下的RNA。
该试剂盒采用的Trizol具有超强的裂解能力和抽提灵敏度，结合试剂盒采用特殊的吸附膜，大大增强了RNA 的得率。
得到的RNA纯度好，完整性高。
该试剂盒适用于各种细胞或组织中的RNA的抽提，提取的总RNA没有DNA和蛋白污染，可用于Northern blot、Dot blot、poly A筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。
本产品具有以下特点：1. 适用范围广。
2. 操作简单快速，整个过程20分钟左右完成。
3. 纯度高，污染少。
试剂准备1. 自备试剂：无水乙醇、氯仿等。
2. 按瓶身标签说明在RPE Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记。
于室温密封保存。
每次使用后将瓶盖盖紧，以保持RPE Solution中的乙醇含量。
若RPE Solution由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。
3. 去酶处理：RNase是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定。
生工基因组提取试剂盒说明书
Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒产品编号：SK8255/SK8256包装规格：50次/100次试剂盒组成组分 SK8255，50次 SK8256，100次纯化套件（吸附柱+收集管） 50套 100套Buffer Digestion 10 ml 20 mlBuffer BD 12 ml 24 mlPW Solution (concentrate) 18 ml 36 mlWash Solution (concentrate)7.5 ml 15 mlCE Buffer (pH 9.0) 15 ml 30 mlProteinase K 1.2 ml 2.4 mlEnzymatic lysis buffer 10 ml 20 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，室温（15~25°C）保存，有效期见包装，4°C保存时间更长。
该试剂盒中提供的Proteinase K溶液为特别优化的配方，方便使用，而且非常稳定，可以在室温保存半年以上而活性不受明显影响，如需进一步延长保存期限，请置4°C保存。
Buffer Digestion中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。
沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
产品介绍本试剂盒是生工生物工程（上海）有限公司最新研制成功的一种细菌基因组DNA抽提试剂盒。
本产品对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用高浓度的蛋白变性剂，大大提高了裂解的效率，缩短了裂解的时间。
无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。
从1 ml过夜培养的细菌菌液可以获得10~20 µg DNA，OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。
抽提出的DNA可用于酶切、PCR、文库构建、Southern blot等相关实验。
标准抽提步骤自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力≥ 12,000 × g）、1.5 ml离心管、无水乙醇、异丙醇、RNase A溶液（20 mg/ml）等。
2种微藻总RNA提取方法的比较
Abstract To select the optimum extraction method for total RNA from microalgae, Trizol method and SDS-LiCl method were used with Chlamydomonas reinhardtii and Micractinium pusillum as materials. The results showed that, high-quality RNA from M. pusillum was obtained by using SDS-LiCl method. In contrast, both Trizol method and SDS-LiCl method were suitable for total RNA extraction from C. reinhardtii. However, the former is more simple and efficient than the latter. The RT-PCR results showed that total RNA isolated from M. pusillum by using SDS-LiCl method and from C. reinhardtii by using Trizol method could be directly used for molecular biology experiments， such as molecular cloning and gene expression analysis. Keywords Chlamydomonas reinhardtii ; Micractinium pusillum ; RNA extraction; SDS-LiCl method ; Trizol method
rna提取实验步骤
RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。
●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
2-8℃10000×g离心15分钟。
收集上清液。
使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。
最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。
此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。
如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。
同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。
细菌总RNA提取方法的比较
细菌总RNA提取方法的比较邹晓蕾，刘礼崔，罗立新（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）摘要：采用改良前后的Trizol法，RNAiso plus法、Qiagen试剂盒法以及Triton X-100法，从大肠杆菌（Escherichiacoli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）3株细菌中提取RNA。
用琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测总RNA 的提取质量，并用R T-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）对RNA的质量进行验证。
结果表明：RNAiso plus法对3株菌的总RNA提取均有很好的效果。
Trizol法和Qiagen试剂盒法对于E. coli总RNA的提取效果不错，但对其他2株菌的提取效果均不明显，并且都伴有DNA污染。
上述几种方法提取出的RNA样品中均含有23S和16S rRNA。
ctis更适合用Triton X-100法提取总RNA。
改良后的Trizol法和RNAiso plus法与Triton X-100法的原理基本相同，都是采用加热的方法，更彻底地裂解细菌细胞，而且得到的RNA中不含有rRNA和tRNA，只保留了mRNA，能更好地用于后续的实验研究。
关键词：细菌；总RNA提取；反转录聚合酶链式反应文章篇号：1673-9078(2013)8-1948-1954Comparison of Different Methods for T otal Bacteria RNA extractionZOU Xiao-lei, LIU Li-cui, LUO Li-xin(College of Bioscience &Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006) Abstract: In this research, RNA was isolated from three bacterial strains, (Escherichia coli, Bacillus subtilis and Lactococcuslactis) by using modified and un-modified Trizol and RNAiso plus methods, Triton X-100 method and Qiagen method. The quality and integrity of the extracted RNA samples were determined with agarose gel electrophoresis, nucleic acid detector and R T-PCR detection. The results demonstrate that un-modified RNAiso plus method can effectively collect high-quality RNA from the three bacterial strains. Qiagen method and un-modified Trizol method showed good efficiency when isolating total RNA from E.coli but other strains. In addition, the RNA samples also contain DNA contamination. L. lactis was more suitable for using Triton X-100 method. With the same principle, modified Trizol method, modified RNAiso plus method and Triton X-100 method reported here can be employed for extraction of RNA that are free from 16S and 23S rRNA and provide simple, rapid and effective tools for the isolation of high-quality RNA appropriate for downstream molecular experiments Key words : bacteria; tatal RNA extraction; RT-PCRRNA是生物体重要的遗传物质，RNA的提取是分子生物学的基础实验，对于cDNA文库构建、荧光定量PCR、R T-PCR、Northern杂交等下游分子生物学实验来说，都需要质量好的，完整性高的RNA[1]。