NGS测序技术与分析流程图
《NGS基础培训》课件
数据分析
对原始数据进行处理、分析和 解读，提取有用的信息。
样本准备
样本类型
根据研究目的和实验需 求选择合适的样本类型
，如血液、组织等。
样本采集
确保采集过程的无菌操 作，避免污染和交叉感
染。
样本保存
选择适当的保存方式， 确保样本在实验前后的
稳定性和一致性。
样本量
根据实验需求确定所需 的样本量，确保实验结 果的可靠性和可重复性
伦理问题
隐私权保护
NGS技术可能涉及个人基因信息，需 确保这些信息不被滥用或泄露。
基因歧视
防止基于基因信息的歧视，确保公平 对待。
临床试验和患者权益
确保临床试验的公正性和患者的知情 同意权。
基因编辑技术的伦理界限
关于基因编辑技术的使用范围和目的 ，应明确其伦理界限。
法律问题
知识产权保护
法律责任和赔偿
对基因的表达产物转录本进行注 释，包括转录本的序列、表达量
、变异等信息。
蛋白质注释
对蛋白质进行注释，包括蛋白质 的序列、结构、功能等信息。
变异检测
单核苷酸变异（SNV）
检测基因组中单个碱基的变异。
结构变异（SV）
检测基因组中的大片段结构变异，如拷贝数 变异、倒位、易位等。
插入和缺失（INDEL）
检测基因组中的片段插入和缺失。
。
数据质量控制
数据完整性
评估原始测序数据的完整性， 确保数据没有缺失或损坏。
数据准确性
对测序数据进行质量评估，确 保数据的准确性和可靠性。
数据重复性
评估测序数据的重复性，确保 数据的一致性和可重复性。
数据可比性
对不同样本或实验条件下的数 据进行可比性分析，确保数据
ngs高通量测序流程
ngs高通量测序流程英文回答：NGS (Next-Generation Sequencing) is a high-throughput sequencing technology that has revolutionized the field of genomics. It allows for the rapid and cost-effective sequencing of large amounts of DNA or RNA samples. The NGS workflow involves several steps, including sample preparation, library construction, sequencing, and data analysis.The first step in the NGS workflow is sample preparation. This involves extracting DNA or RNA from the biological sample of interest. The quality and quantity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of downstream steps. Various extraction methods and kits are available depending on the sample type.Once the nucleic acids are extracted, the next step is library construction. In this step, the DNA or RNA isfragmented into smaller pieces, and adapters are added to the ends of the fragments. These adapters contain sequences that are necessary for the attachment of the fragments to the sequencing platform. The size selection of the fragments is also performed to ensure that only the desired fragment lengths are sequenced.After library construction, the samples are ready for sequencing. There are different sequencing platforms available, such as Illumina, Ion Torrent, and PacBio. Each platform has its own advantages and limitations in terms of read length, throughput, and error rate. The choice of platform depends on the specific research needs and budget.During the sequencing process, the DNA or RNA fragments in the library are amplified and attached to a solid surface, such as a flow cell in the case of Illumina sequencing. The fragments are then sequenced using fluorescently labeled nucleotides, and the emitted signals are detected and converted into digital data.Once the sequencing is complete, the raw data undergoesquality control and data analysis. Quality control involves checking the sequencing quality scores, read length distribution, and other metrics to ensure the reliability of the data. Data analysis involves aligning the reads to a reference genome or transcriptome, identifying genetic variations, and quantifying gene expression levels.NGS has a wide range of applications in genomics research, including genome sequencing, transcriptome analysis, epigenetics, metagenomics, and personalized medicine. It has enabled researchers to study complex biological processes at an unprecedented level of detail and has led to significant advancements in our understanding of genetics and disease.中文回答：NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量测序技术，已经彻底改变了基因组学领域。
二代测序分析流程
二代测序分析流程Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics by allowing researchers to rapidly sequence large amounts of DNA and RNA. 二代测序（NGS）已经彻底改变了基因组学领域，使研究人员能够快速测序大量的DNA和RNA。
This technology has enabled the analysis of entire genomes, transcriptomes, and epigenomes, providing a wealth of data that can be used to study genetics, disease, and evolution. 这项技术使得对整个基因组、转录组和表观基因组的分析成为可能，为研究遗传学、疾病和进化提供了大量的数据。
One of the key challenges in NGS is the analysis of the data generated, which requires a complex and multi-step process to extract useful information. 二代测序面临的关键挑战之一是分析生成的数据，这需要复杂且多步骤的过程来提取有用的信息。
The NGS analysis pipeline typically involves several key steps, including quality control, read mapping, variant calling, and downstream analysis. 二代测序分析流程通常包括几个关键步骤，包括质量控制、读片段比对、变异检测和下游分析。
ngs与其他检测序技术流程的对比图文
NGS技术特点及优势
精准度高 检测全面
高通量测序
世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600 次以上，杜绝假阳/阴性结果
单次检测中同时发现多个基因的多种突变 包括 单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合
上一代传统基因检测
技术局限，假阳/阴性错误率高
单次反应只能针对一种突变进行检 测，并只能检测一种突变类型
分析
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Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
荧光原位杂交(FISH)检测——以HER2为例
FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增
DNA序列测定的意义
DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
1、成本较高 2、引入PCR过程会在一定程 度上增加测序的错误率，并且 具有系统的偏向性，同时读长 也比较短 3、对数据注释和报告解读要 求高
19
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点突变、小片段插入/缺失
点突变 扩增 融合/重排 插入/缺失
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NGS与液体活检结合可有效解决传统检测面临的挑战
• 高敏感度检测 低丰度突变
组织、胸水、 ctDNA
NGS测序技术与分析流程图
数据格式示例
• Fastq 格式
• Color Space 格式
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Phred score
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质量控制
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利用galaxy进行原始数据处理
https:///
精品课件
Galaxy History ' VGN FASTQ'
https:///u/jjv5/h/unnamed-history-1
Ion torrent
Ion Torrent 测序原理
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精度
• Examples:
• • 90% confidence (10% error rate) =
Q10
• • 99% confidence (1% error rate) =
Q20
• • 99.9% confidence (.1% error rate) =
精品课件
测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100 多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系 统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
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454 Pyrosequencing
精品课件
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454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是 噬菌体X174的，全长5375个碱基
精品课件
• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基， 其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用 来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入 一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显 影后可以根据电泳带的位置精品确课件定待测分子的DNA序列
NGS基础培训课件
生物信息分析问题
总结词
生物信息分析是ngs数据分析的核心步骤，但也存在一些问题。
详细描述
生物信息分析主要包括数据预处理、比对、变异检测和注释等方面。数据预处理主要包括质量控制、降噪和过 滤等步骤；比对主要包括与参考基因组进行比对和可视化等步骤；变异检测主要包括单核苷酸变异、插入缺失 和结构变异等检测；注释主要包括基因和通路富集分析、疾病关联分析和突变类型分析等步骤。
建库原理
核酸提取
核酸提取的目的是富集目标序列，去除其他杂质。
末端修饰
在建库过程中，需要将DNA或RNA某种方法将中的序列进行富集和去除不需要的序列。
03
ngs数据分析流程
下一代测序技术是继第一代测序技术Sanger后，发展起来的 高通量测序技术，能够一次处理大量序列信息。
测序流程
下一代测序的流程主要包括样本准备、构建、测序反应 、数据分析等环节。
测序原理
链终止法
链终止法是利用核苷酸特异性的终止剂，使得ddNTP可以终止DNA聚合酶的 延伸反应。
高通量测序
高通量测序是下一代测序技术的主要特点，能够在短时间内对大量序列进行 测序。
数据预处理
质量控制
使用FastQC等工具对原始数 据进行质量控制，检测数据中 是否存在可疑序列、高通量测
序的偏差等。
去除批次效应
将不同批次的数据进行归一化处 理，以去除批次效应，便于后续 分析。
数据过滤
根据质量控制结果，对数据进行过 滤，去除低质量的数据。
序列比对
选取比对算法
使用比对算法将序列与参考基 因组进行比对，如Bowtie、
随着技术的不断进步，NGS在生命科学研究中的 应用领域越来越广泛，从基因组学到转录组学、 表观组学等多个领域。
NGS系列讲座——NGS基本原理ppt课件
3’
5’
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT
21 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTAGCGC
26 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA
22 bp
11
Sanger 测序
Prime
5’ T G C G rC G G C C C A G T C T T G G G C
ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG
3’
5’
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT
21 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTAGCGC
26 bp
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Sanger 测序
Prime
5’ T G C G rC G G C C C A G
ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG
NGS系列讲座（一）—— NGS简介及原理
2017/06/01 魏冬凯
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Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理
2
Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理 其他平台测序技术简介
3
什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？
DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片 段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C） 与鸟嘌呤的（G）排列方式。
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测序种类
Single-Read Sequencing(SR)
Paired-End Sequencing(PE) Index Sequencing(PE)
39
测序种类
《NGS基础培训》课件
2023《ngs基础培训》课件contents •ngs基本概念及发展历程•ngs工作原理及测序技术•ngs在临床疾病研究中的应用•ngs在生物进化研究中的应用•ngs在环境科学中的应用•ngs技术在未来医学中的应用前景目录01ngs基本概念及发展历程下一代测序技术(NGS)是一种高通量的生物学技术，可以对基因组进行大规模、并行、快速、准确的测序。
NGS技术具有高速度、高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和可重复性等优点。
ngs定义与特点ngs发展历程人类基因组计划完成了人类基因组的初步测序。
2005年2007年2010年2012年第一台下一代测序仪(Solexa)问世，标志着NGS时代的到来。
测序技术的快速发展，使得一天内能够完成人类基因组的测序。
单分子测序技术(PacBio RS)的出现，打破了基因组测序的限制。
ngs应用领域生物进化研究等药物研发和个性化治疗罕见疾病研究遗传疾病诊断和预防肿瘤诊断和治疗02ngs工作原理及测序技术总结词双端测序技术是NGS中应用最为广泛的技术之一，可以有效测定生物体基因组的变异情况。
详细描述双端测序技术是一种基于高通量测序平台的技术，它可以从生物体的两端同时进行测序，从而获得基因组的正反方向序列。
这种方法可以大大提高测序的精度和效率，同时减少测序成本。
双端测序技术总结词单端测序技术是一种简单有效的NGS技术，适用于对特定基因或DNA片段进行深入研究。
详细描述单端测序技术只对DNA的一条链进行测序，因此可以快速获得大量序列数据，并且可以有效降低测序成本。
但是这种方法无法测定基因组的整个序列，需要结合其他技术进行分析。
单端测序技术序列组装和基因组构建是NGS技术的关键环节，对于后续的基因组分析和研究至关重要。
详细描述序列组装是将测序得到的数千个序列片段进行拼接和排列，从而得到完整基因组序列的过程。
基因组构建是在序列组装的基础上，根据生物体的基因组结构特点构建基因组图谱的过程。
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测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100 多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系 统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
精品课件
454 Pyrosequencing
精品课件
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454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
• 454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公 司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测 序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》 杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序 （sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被 罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
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测序实验流程：
• 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后 放入PTP板中进行后继的测序。 PTP孔的直径（29um）只 能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中， 测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生 化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；
新一代测序介绍
Lynx MPSS
454
Polony Seq
• 三Sol大ex测a 序平台Roc的he前45世4 今A生BI SOLiD
Illumina Solexa
Helicos
Ion Torrent
ABI Ion Torrent
SMRT
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Pacific Biosciences
Roche-454
B. SOLiD 测序结果示例（Color Space)
A. SOLiD Oligo荧光基团模式图
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SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
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测序实验流程：
• 2、Emu大部分磁珠磁珠携带个独特的片断在自己的微反应器里 进行独立的扩增，而不受其他同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结 合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是 噬菌体X174的，全长5375个碱基
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• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基， 其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用 来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入 一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显 影后可以根据电泳带的位置精品确课件定待测分子的DNA序列
• Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团 进行检测
SOLiD 5500xl
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ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化 磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
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C 磁珠富集 转到测序玻片
ABI SOLiD测序原理
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ABI SOLiD荧光结合和结果示例
@SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078 @SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 T202312302.3333130131131322113203131 +SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 !9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,
• 454测序原理
精品课 DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异 性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）； 然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、B进行平 端连接。A、B 衔接子各自含有20个碱基的PCR 引物序列、 20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG）， 除此之外，B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团，供 后续的分离合适的测序模板使用。
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78Biblioteka 9TTTTTTTGT…
精品课件
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
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ABI SOLiD
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection
1st cycle extension
diol diol
2nd cycle denaturation
diol
diol diol
2nd cycle extension
精品课件
diol
diol diol
2nd cycle annealing
Illumina Solexa Base Calling
T G C TAC GAT …
精品课件
Illumina solexa
• Solexa 测序原理
精品课件
Illumina solexa
精品课件
Illumina Solexa 桥式PCR
diol diol
1st cycle denaturation
diol diol
1st cycle annealing
n=35 total
diol diol