最新ELISA实验原理及操作
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。
该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。
2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。
该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。
3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。
酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。
4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。
操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。
将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。
2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。
3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。
4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。
5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。
6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。
7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。
8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。
9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。
10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。
elisa检测方法的原理（酶联免疫吸附试验）
elisa检测方法的原理（酶联免疫吸附试验）【实验原理】酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的基本原理是：由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去游离的反应物，从而保证实验结果的特异性与稳定性，且最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，从而使该测定方法具有高敏感度。
具体的方法较多，有用于检测抗体的间接法（图8-1）、用于检测抗原的双抗体夹心法（图8-2）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
图8-1 ELISA间接法图8-2 ELISA双抗体夹心法【材料与仪器】1. 包被缓冲液（pH9.6的0.05mol／L碳酸盐缓冲液）、洗涤缓冲液（pH7.4的0.15mol／LPBS）、底物缓冲液（pH5.0柠檬酸－磷酸氢二钠）、终止液2mol／LH2SO4、抗原、抗体及酶标记抗体、正常人血清和阳性对照血清、TMB。
2. 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔、ELISA检测仪、50μl、100μl微量加样器、塑料滴头、小毛巾、洗涤瓶、小烧杯、玻璃棒、试管、吸管、量筒等。
3.4℃冰箱、37℃孵育箱。
【实验方法】一、ELISA间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为：利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
1. 包被固相抗原：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min，除去未结合的抗原及杂质。
2.加待检标本：加一定稀释度的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min，除去未结合的抗体及杂质。
ELISA实验原理和操作
100ul
37℃，60 min 洗板3次
酶标板
4. 酶标二抗旳结合
酶标抗体用稀释液稀释至工作浓度后，加入每孔中， 100ul/孔，置湿盒中放37℃ 30min。洗板3次。
5. 加入底物显色液（用前再配制，并置棕色瓶内）
每孔加入底物显色液，100ul/孔，湿盒中37℃保温一定 时间。
6. 终止反应
电子致密物质等作为示踪剂，标识抗体或抗原进行 旳抗原抗体反应。
特点：高度敏捷、特异、迅速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体旳特异性免疫反应与酶 旳催化反应相结合而建立旳一种免疫检测 技术。
2. 在实际操作中，你以为有哪些原因能够影响定量 检测旳成果？（操作中应注意旳问题）
3. 试验设计题：怎样用竞争ELISA来定量检测抗体？
ELISA检测抗原
Ag + Ab* ↔ Ag-Ab*
ELISA检测抗体
Ab + Ag* ↔ Ab-Ag*
ELISA检测抗体
Ag + Ab1 ↔ Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ↔ Ag-Ab1-Ab2*
ห้องสมุดไป่ตู้
竞争 ELISA 检测 抗原
固定OD值
试验材料：
• 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） • 已知含量旳人血清白蛋白（作原则曲线） • 待检人血清白蛋白 • 辣根过氧化物酶标识旳驴抗羊抗体（二抗） • 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲
就是利用酶标识抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体旳一种免疫学标识技术。
elisa检测实验报告
elisa检测实验报告ELISA 检测实验报告一、实验目的本次 ELISA 检测实验的目的是定量检测样本中特定抗原或抗体的浓度，以评估实验对象的生理或病理状态。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。
其基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，然后加入待检样本，样本中的待测抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标记抗体复合物。
最后，加入底物，酶催化底物反应生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度值，即可定量分析样本中待测抗原或抗体的浓度。
三、实验材料与设备1、试剂包被缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 96）封闭液（含 1% 5% 牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液）洗涤液（含 005% Tween-20 的 PBS 缓冲液）样本稀释液（PBS 缓冲液）标准品（已知浓度的抗原或抗体）酶标记的二抗（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记）底物溶液（如 TMB 或 pNPP）终止液（如 2M 硫酸或 1M 氢氧化钠）2、仪器与设备酶标仪（能够读取 450nm 或 492nm 波长的吸光度值）恒温培养箱移液器（量程分别为20μL、200μL、1000μL）聚苯乙烯微孔板离心机四、实验步骤1、包被将已知浓度的抗原或抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度。
向聚苯乙烯微孔板的每孔中加入100μL 稀释后的包被液，4℃过夜或 37℃孵育 2 3 小时。
2、封闭倒掉包被液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，每次浸泡 3 分钟，然后拍干。
每孔加入200μL 封闭液，37℃孵育 1 2 小时。
3、加样倒掉封闭液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，然后拍干。
将待检样本和标准品用样本稀释液进行梯度稀释。
向微孔板的每孔中分别加入100μL 稀释后的样本和标准品，空白对照孔加入100μL 样本稀释液。
37℃孵育 1 2 小时。
ELISA原理、方法、操作及注意事项解析
双抗原夹心法测抗体
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竞争法检测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去 ，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用竞争法检测特异性抗体。
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竞争法测抗体
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竞争法测抗体
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竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可 作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可 以采用竞争法模式。小分子激素 、 药物等ELISA测定多用此法。
（1） 标本 可用作ELISA测定的标本十分 广泛，大部分ELISA检测均以血清 为标本。血清标本按常规方法采集， 应注意避免溶血，红细胞溶解时会 释放出具有过氧化物酶活性的物质， 以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体 中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如 在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃， 超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白 质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气 泡，可上下颠倒混和 ，不要在混匀器上强烈振荡。 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再 检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血 清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存 血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐 剂。
ABS-ELISA法
Title in here
3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。
它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。
一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。
2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。
3.清洗：去除未结合的物质。
4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。
5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。
6.分析：对信号进行测量和定量分析。
二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。
-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。
-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。
2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。
-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。
-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。
3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。
-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。
4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。
-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。
6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
7.加入底物：-加入适合的底物。
-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。
8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。
9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。
-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。
三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。
-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。
elisa四种方法原理
elisa四种方法原理
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）原理：
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）是一种常见的免疫检测技术，可用于检测抗原（病原微生物或其产物）或抗体（就是人体免疫合成的抗体）。
ELISA技术是由美国科学家Engvall和 Perlmann在1971年开发的。
其原理是用待检样品中特异性的抗原或抗体，经过酶标记或免疫吸附后，与特异性的抗体或抗原结合，形成特异性的复合物，然后用酶试剂和酶色物质，利用酶-物质反应的特异性相互作用，使用特异性发光来检测复合物，从而实现抗原或抗体检测的目的。
ELISA可以分为四种：
1、双抗体免疫吸附ELISA法：在试剂盒中，将抗原（如病毒）固定在培养皿内，然后用一抗原特异性的抗体将抗体特异性的抗体结合起来；最后，添加特异性的抗体作为酶色原料，重复几次，即可得出检测结果。
2、双抗原免疫吸附ELISA：该法与上述方法类似，只是将抗原替换为特异性的抗体，而其余程序不变。
3、原位抗原免疫吸附ELISA：该方法与上述两种方法类似，但是在结合的特异性抗体上加入特异性的抗原，并将其结合在一起，用酶试剂和酶色物质来检测抗原-抗体复合物。
ELISA实验原理
一．ELISA实验原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
二．实验材料与试剂配制：1.仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。
2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。
三．样品收集、处理及保存1）.细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。
用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。
2）细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。
3）血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。
4）血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。
5）体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。
使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。
6.）组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。
样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
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电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
2. 在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响定量 检测的结果？（操作中应注意的问题）
3. 实验设计题：如何用竞争ELISA来定量检测抗体？
ELISA实验原理及操作
ELISA实验原理及操作
ELISA检测抗体
Ag + Ab1 ↔ Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ↔ Ag-Ab1-Ab2*
ELISA实验原理及操作
ELISA实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理及操作
竞争 ELISA 检测 抗原
ELISA实验原理及操作
固定OD值
ELISA实验原理及操作
实验材料：
• 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） • 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） • 待检人血清白蛋白 • 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） • 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲
待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 250ul抗体
100ul 标准抗原
50ul
50ul
稀释板
50ul 稀释液
待测抗原 PBS
50ul
50ul
ELISA实验原理及操3作7℃，30 min
3. 与固相抗原的竞争结合
取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入 酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60 min。洗 板3次。
assay）
是一类常用的免疫酶技术。是将已知的 抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗 原抗体反应在固相表面进行。
常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
ELISA实验原理及操作
ELISA检测抗原
Ag + Ab* ↔ Ag-Ab*
ELISA实验原理及操作
ELISA检测抗体
Ab + Ag* ↔ Ab-Ag*
稀释板
100ul
37℃，60 min ELISA洗实验板原3理次及操作
酶标板
4. 酶标二抗的结合
酶标抗体用稀释液稀释至工作浓度后，加入每孔中， 100ul/孔，置湿盒中放37℃ 30min。洗板3次。
5. 加入底物显色液（用前再配制，并置棕色瓶内）
每孔加入底物显色液，100ul/孔，湿盒中37℃保温一定 时间。
实验五 免疫酶技术及其应用 ——ELISA
ELISA实验原理及操作
一、实验目的
A. 了解和掌握免疫酶技术的测定原理。 B. 掌握酶联免疫吸附测定技术的操作步骤，学会利
用竞争ELISA的方法，定量测定抗体或抗原。 C. 了解免疫酶技术在生物学和医学研究的重要意义
及应用价值。
ELISA实验原理及操作
二、实验原理
液 • 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS • 底物溶液：OPD-H2O2 • 终止液：2mol/L H2S04 • 酶标反应板（一条/人）
ELISA实验原理及操作
三、操作步骤
1. 包被抗原
抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标 板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。
抗原100ul/孔
酶标板
湿盒中，4℃过夜
次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后 倾去），以洗去未包被的游离抗原。
ELISA实验原理及操作
2. 抗原与抗体的预孵育
3. 制作标准曲线：
在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度 的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓 度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30 min。
ELISA实验原理及操作
• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶 的催化反应相结合而建立的一种免疫检测 技术。
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。
ELISA实验原理及操作
• 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent
6. 终止反应
待出现明显颜色反应（或一定时间）后，加入终止液， 50ul/孔以终止反应。
7. 结果测定
用酶标仪在492nm波长下测定OD值。 以标准抗原的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘 制标准曲线，计算未知抗原的浓度。
ELISA实验原理及操作
四、思考题
1. 在定量测定抗原时，直接ELISA与竞争ELISA有何 区别？从理论上分析一下各自的优缺点。