第六章 微生物菌种的筛选与保藏
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（2022年修订）
动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（2022年修订）文章属性•【制定机关】农业农村部•【公布日期】2022.01.07•【文号】农业农村部令2022年第1号•【施行日期】2022.01.07•【效力等级】部门规章•【时效性】现行有效•【主题分类】种植业正文动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（2008年11月26日农业部令第16号公布，2016年5月30日农业部令2016年第3号、2022年1月7日农业农村部令2022年第1号修订。
）第一章总则第一条为了加强动物病原微生物菌（毒）种和样本保藏管理，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《兽药管理条例》等法律法规，制定本办法。
第二条本办法适用于中华人民共和国境内菌（毒）种和样本的保藏活动及其监督管理。
第三条本办法所称菌（毒）种，是指具有保藏价值的动物细菌、真菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、病毒等微生物。
本办法所称样本，是指人工采集的、经鉴定具有保藏价值的含有动物病原微生物的体液、组织、排泄物、分泌物、污染物等物质。
本办法所称保藏机构，是指承担菌（毒）种和样本保藏任务，并向合法从事动物病原微生物相关活动的实验室或者兽用生物制品企业提供菌（毒）种或者样本的单位。
菌（毒）种和样本的分类按照《动物病原微生物分类名录》的规定执行。
第四条农业农村部主管全国菌（毒）种和样本保藏管理工作。
县级以上地方人民政府畜牧兽医主管部门负责本行政区域内的菌（毒）种和样本保藏监督管理工作。
第五条国家对实验活动用菌（毒）种和样本实行集中保藏，保藏机构以外的任何单位和个人不得保藏菌（毒）种或者样本。
第二章保藏机构第六条保藏机构分为国家级保藏中心和省级保藏中心。
保藏机构由农业农村部指定。
保藏机构保藏的菌（毒）种和样本的种类由农业农村部核定。
第七条保藏机构应当具备以下条件：（一）符合国家关于保藏机构设立的整体布局和实际需要；（二）有满足菌（毒）种和样本保藏需要的设施设备；保藏高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本的，应当具有相应级别的高等级生物安全实验室，并依法取得《高致病性动物病原微生物实验室资格证书》；（三）有满足保藏工作要求的工作人员；（四）有完善的菌（毒）种和样本保管制度、安全保卫制度；（五）有满足保藏活动需要的经费。
微生物菌种的保藏方法
微生物菌种的保藏方法1微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏是生物学研究的重要环节，它也是生物资源的基础。
微生物的保藏需要充分的考虑长期保藏的要求，能有效防止细菌的腐败，缩短菌株检疫和检测所需的时间，还可以提高细菌新特征的研究成果。
但是，由于不同物种之间的差异性，微生物菌种的保藏可能涉及各种复杂的方法，需要更加正确和有效的保藏来保护和维护菌株。
1.1定期替换培养基微生物菌种的保藏通常使用加入防腐剂的培养基进行贮藏，但是由于长时间的贮藏，培养基的成分会逐渐减少，菌株也会逐渐衰老，这可能会影响到菌株的存活率和活跃度。
所以，贮藏前应加入新鲜的培养基和抗生素，定期替换新鲜培养基，以保证菌株的流动性。
1.2贮存条件的控制正确控制贮存条件，如温度、湿度、控制空气的酸碱度等，可以使菌株的活跃性或存活率保持最佳状态。
一般来说，细菌能够在室温（25度）下长期贮存，但是会减慢其增殖和繁殖的速度，同时还要注意湿度，太过潮湿会使细菌存活率降低，尤其是嗜水性细菌；而太过干燥则会造成菌株衰老，影响菌株的存活率并降低其活力。
1.3贮藏容器的选择贮藏容器也是微生物菌种保藏的重要组成部分，不同种类的细菌需要不同种类的容器来保存。
一般来说，普通细菌能够在塑料袋或瓶中长期贮存，只需每隔一段时间就更换新的瓶或袋，但对于致病细菌则必须使用带有封闭口的易破袋。
1.4贮藏环境的更新贮藏环境的更新也是保藏细菌的重要环节。
定期更换菌种本身的培养环境，例如移动菌瓶到新的室温，或将菌瓶置于新的室温环境中，可以有效提高菌种的活跃性，同时也可以更换新的培养基和抗生素，定期更新贮藏环境，有效规避细菌衰老的问题，确保细菌的存活率和增殖率。
以上就是微生物菌种的保藏方法，主要涉及到定期替换培养基、贮存条件的控制、贮藏容器的选择以及环境的更新等，只有正确地运用它们，才能确保菌株的存活率和活动性。
微生物的分离培养和菌种保藏
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菌种保藏技术的改进
现有的菌种保藏技术存在一些局限性， 如长期保藏过程中菌种活力的下降等， 如何改进这些技术以提高菌种的保藏 效果是另一个挑战。
培养基和培养条件的优化
不同微生物对培养基和生长条件的需 求各异，如何优化这些条件以适应各 种微生物的生长是一个重要问题。
伦理和法规问题
在微生物分离培养和菌种保藏过程中， 可能涉及到伦理和法规问题，如人类 微生物、病原体和转基因微生物的管 理等。
未来的发展方向
开发新的培养方法和技术
随着技术的发展，未来将开发出更多新的培养方法和技术，以满足各 种微生物的培养需求。
提高菌种保藏效果
未来将致力于改进菌种保藏技术，提高菌种保藏效果，延长菌种寿命。
加强微生物多样性保护
未来将更加重视微生物多样性保护，采取有效措施保护珍贵的微生物 资源。
加强伦理和法规建设
选择性分离法
利用培养基或试剂的选择性抑 制某些微生物的生长，从而分 离出所需的特定微生物。
温度、酸碱度分离法
通过调节培养基的温度、酸碱 度等条件，使适应特定条件的
微生物得到分离。
微生物分离的步骤
1 2
采集样品
根据需要选择合适的微生物样品，如土壤、水、 空气等。
样品处理
将采集的样品进行适当的处理，如稀释、研磨等。
在医学和药学中的应用
抗生素耐药性研究
分离培养耐药性微生物，研究其耐药机制，有助于开发新的抗生 素药物。
疫苗制备
通过分离培养病原微生物，制备疫苗，预防和控制传染病。
药物筛选
动物病原微生物菌(毒)种保藏管理办法(农业部令第16号)
动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法（农业部令第16号）动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法(农业部令第16号)2008年11月4日农业部令第16号公布，农业部令2016年第3号修订。
第一章总则第一条为了加强动物病原微生物菌（毒）种和样本保藏管理，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《兽药管理条例》等法律法规，制定本办法。
第二条本办法适用于中华人民共和国境内菌（毒）种和样本的保藏活动及其监督管理。
第三条本办法所称菌（毒）种，是指具有保藏价值的动物细菌、真菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、病毒等微生物。
本办法所称样本，是指人工采集的、经鉴定具有保藏价值的含有动物病原微生物的体液、组织、排泄物、分泌物、污染物等物质。
本办法所称保藏机构，是指承担菌（毒）种和样本保藏任务，并向合法从事动物病原微生物相关活动的实验室或者兽用生物制品企业提供菌（毒）种或者样本的单位。
菌（毒）种和样本的分类按照《动物病原微生物分类名录》的规定执行。
第四条农业部主管全国菌（毒）种和样本保藏管理工作。
县级以上地方人民政府兽医主管部门负责本行政区域内的菌（毒）种和样本保藏监督管理工作。
第五条国家对实验活动用菌（毒）种和样本实行集中保藏，保藏机构以外的任何单位和个人不得保藏菌（毒）种或者样本。
第二章保藏机构第六条保藏机构分为国家级保藏中心和省级保藏中心。
保藏机构由农业部指定。
保藏机构保藏的菌（毒）种和样本的种类由农业部核定。
第七条保藏机构应当具备以下条件：（一）符合国家关于保藏机构设立的整体布局和实际需要；（二）有满足菌（毒）种和样本保藏需要的设施设备；保藏高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本的，应当具有相应级别的高等级生物安全实验室，并依法取得《高致病性动物病原微生物实验室资格证书》；（三）有满足保藏工作要求的工作人员；（四）有完善的菌（毒）种和样本保管制度、安全保卫制度；（五）有满足保藏活动需要的经费。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
2、传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
第六章 工业微生物产生菌的分离筛选
第二节 含微生物样品的富集培养
富集培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物 的生理特性设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件， 使目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由 自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种以利分离到 所需要的菌株。
富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、 需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进 行富集。
一、土壤中采样
土壤是人类最丰富的菌种资源库。
一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的 含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌 （107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原 生动物（103），
（一）根据土壤特点
1、土壤有机质含量和通气状况
耕作土、菜园土、津郊土壤；森林土，采土样最好 的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几 十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离 到。
1. 根据微生物营养类型
森林土 纤维素酶产生菌 ； 蛋白酶和脂肪酶 蛋白 肉类加工厂附近和饭店排水沟 的产生菌；
面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂 酶、糖化酶的菌株 ；
蜂蜜、蜜饯、甜果
酵母；
２. 根据微生物的生理特性
高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、 火山爆发处及北方的堆肥中采集样品； 分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、 冰窖、深海中采样； 分离耐压菌则通常到海洋底部采样。
产生电子脱色，形成淡白色晕圈。
3、生长圈法
用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。
利用某些具有特殊营养要求的微生物（营养缺陷型菌 株）作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下 生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈 。 如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合 倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长 圈的菌落即为嘌呤产生菌。
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（四）菌种保藏机构 1、中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM
中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学 院)
中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科
学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
刃天青 偶氮间苯四酚 resazurin
氧化还原指示剂，在缺氧环境下由粉红变为无色。
（2）创造无氧环境 物理除氧
空气臵换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg→充入N2 （反复3次）→充入CO2
10% +H2 10% + N2 80%
化学除氧
H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学
4. 方法
（1）控制营养成分 ① 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 ② 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 ③ 酒精废水，可以增殖废水利用菌
* 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素
（2）控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制
(2) 向菌种自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中 有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。
从自然界中分离筛选菌种的一般步骤 筛选目标→设计方案
采样
增殖培养
平板分离
性能考察(生 产性能试验、 菌种鉴定）
筛选(初筛、 复筛)
单株纯种分 离
一、采样
从自然界种采集含目的菌的样品
1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响
（1）营养环境 ①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤 中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌； ②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生 菌； ③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌； ④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋 白酶产生菌； ⑤油田土：石油分解菌 ；
中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）
中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)
中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)
中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
第六章 微生物菌种的筛 选与保藏
本章要点 如何按目的要求筛选菌株 微生物菌种保藏方法 了解国内外各大菌种保藏机构
种 （speci
es）
≠
菌株
>
（strain）
第一节 从自然界中分离筛选菌种
生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育
(1) 用原有菌株进行遗传改造进行育种
① 诱变育种 ② 基因重组育种
（二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种， 并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢 不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促
反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白、海
3、淘汰已衰退的个体 对S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢子
采用-10~-30℃的低温处理5~7天，使其死亡率达到 80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化 的个体，从而达到复壮的效果。
三. 菌种的保藏
（一）目的
使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不 死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。
刚果红与纤维素等多糖物 质形成红色复合物
淀粉遇碘变蓝 抑菌圈
3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh
煮沸法：将培养基臵沸水中煮沸15分钟，驱除其中的 溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下
培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨 酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh
（3）控制培养温度 30℃左右培养，可培殖嗜温微生物 50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株
（4）热处理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体， 再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌
（5）添加抑制剂 10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌 抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制毒菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌
藻糖。 添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法 1、斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏
措施：低温：4℃ 适用：各大类 保藏期：1~6个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液蜡 高出培养 基1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年 优点：简便
3、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干
燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年
4、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管
中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至 0.01mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5~15年或更长
种量，培养温度… 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡
剂…
第二节 菌种退化、复壮与保藏
在生物进化中： 遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的；
在变异中： 退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。
一.菌种的退化 1、菌种退化degeneration的表现
3 注意
记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离
红树林
二. 增殖培养（富集培养） 适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得
以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制
（4）采用有效的菌种保藏方法
二. 菌种的复壮 rejuvenation 狭义复壮
在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测 定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施；
广义复壮 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常
有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期 从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种。
三. 纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得
纯培养 1、纯种分离的一般方法
（1）稀释平板法 倾注平板或涂布平板 （2）划线法
稀释分离涂布平板
划线分离
（3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消
毒处理→无菌水冲洗→臵琼脂平板上→培养→长出 菌丝体 或：→悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内→培养→长 出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌： ① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖
（3）变色圈法
淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液：
蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶
（4）生长圈法
工具菌：
营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积 累的产物
菌落形态明显不同于目的菌
方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂 培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌
生产性状的劣化,遗传标记的丢失, 原有的典型性状的 不典型等
菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降，即负突变 致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱
2. 菌种退化的原因：基因自发突变
退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步 演变过程。
5、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 → 15~30%甘油缓冲液悬浮 →
加入保藏管中 → 臵 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年
6、液氮保藏法 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中
→ 臵液氮瓶中 措施：超低温（-196℃）、保护剂 适用：各大类 保藏期：>15年
复壮方法 1、纯种分离法
平板表面涂布法
纯种分离法
菌落纯 （菌种纯）
细胞纯 （菌株纯）
平板划线分离法 琼脂培养基浇注法 用“分离小室”进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分
离
2、通过宿主体复壮：病原菌
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云 金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫 率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫， 然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复 多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接, 结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上, 令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮 性能就可恢复甚至提高。
（2）水分 ①离地表5-15cm土样 ②含水过多、过少都不理想
（3）温度：采样以秋季为好 （4）通风 （5）酸碱度：
细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸
2 .采样方法
（1）去除表层土 （2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆
料袋中 （3）植物根、茎、叶、花、果实。