MISEQ数据处理步骤
miseqfgx法医基因组二代测序原理
miseqfgx法医基因组二代测序原理一、引言法医基因组二代测序（miseqfgx）是一种重要的生物技术，广泛应用于法医鉴定、遗传学研究等领域。
本文将介绍法医基因组二代测序的原理、实验流程及其在法医学中的应用。
二、原理法医基因组二代测序的基本原理是基于高通量技术。
其基本步骤包括：DNA 提取、模板制备、测序反应、数据解析等。
首先，从样本中提取出DNA，将其打断成小片段后加入接头，再进行PCR扩增。
接下来，通过高通量测序仪对经过处理的DNA模板进行测序，得到大量的序列数据。
最后，通过生物信息学分析，将这些序列数据转化为基因组信息，从而实现对样本的鉴定。
三、实验流程1. 样本采集：收集含有DNA的样本，如血液、精液、毛发等。
2. DNA提取：对样本进行提取，得到较为纯净的DNA。
3. 模板制备：将DNA打断成小片段，并加入接头。
接头的目的是为了稳定片段并增加序列信息。
4. 测序反应：将带有接头的DNA片段加入测序仪进行测序，得到序列数据。
5. 数据解析：对测序仪得到的原始数据进行处理，包括去除噪音、拼接序列、注释基因等步骤，以获得基因组信息。
四、应用法医基因组二代测序在法医学中的应用主要体现在以下几个方面：1. 亲子鉴定：通过比较样本和疑似父亲的基因组信息，可以确定是否存在亲子关系。
2. 遗传疾病研究：通过对患病家系的基因组信息进行分析，可以研究遗传疾病的发病机制和基因变异。
3. 法医案件分析：通过比较犯罪现场的生物样本和嫌疑人的基因组信息，可以进行个体识别和种属鉴定。
4. 种群遗传学研究：通过对不同群体基因组信息的分析，可以研究种群的遗传结构和生活史。
五、结论法医基因组二代测序作为一种重要的生物技术，具有高通量、高灵敏度、高精度等优点，在法医鉴定、遗传学研究等领域发挥着越来越重要的作用。
随着技术的不断进步，法医基因组二代测序将在更多领域得到应用，为人类健康和科学发展做出更大的贡献。
六、参考文献（此处省略参考文献）七、致谢感谢各位读者对法医基因组二代测序的支持和关注，希望能为大家提供有益的信息和帮助。
二代dna测序技术数据的处理流程
二代dna测序技术数据的处理流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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基因组测序仪MiSeqDx使用手册说明书
MiSeq TM Dx使用手册MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 1 2020年12月Material # 20030132引言本文档及其内容是Illumina，Inc.及其附属公司（“Illumina”）所有，并且仅供与所述产品相关的合同约定的客户使用，无其他用途。
未经Illumina事先书面同意，本文件及其内容不得以其他方式传播、披露或转载和/或用于任何其他目的。
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Illumina, MiSeq TM Dx，南瓜橙颜色和流动底纹设计是Illumina, Inc.和/或其在美国和/或其他国家/地区附属公司的商标。
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MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 2 2020年12月Material # 20030132修订历史MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 3 2020年12月Material # 20030132目录引言 (2)修订历史 (3)目录 (4)第一章概述 (6)产品名称 (6)预期用途 (6)产品结构及组成 (6)第二章设备安装及环境要求 (14)运输和储存 (14)运输和安装 (14)实验室要求 (15)电气要求 (17)环境要求 (18)网络要求 (18)用户自备耗材和设备 (19)第三章工作原理 (21)工作原理 (21)需要但不提供的设备和材料 (21)第四章性能指标 (22)仪器技术指标 (22)仪器使用期限 (23)产品合规性和监管声明 (23)第五章运行操作 (26)P ART וL OCAL R UN M ANAGER（本地运行管理） (26)本地运行管理 (26)登陆信息管理 (26)操作界面概述 (27)管理设置和任务 (31)工作流程概述 (37)P ART װM I S EQ O PERATING S OFTWARE (M I S EQ操作软件) (41)启动和开机 (41)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 42020年12月Material # 20030132测序运行 (43)结果分析 (54)质量控制 (55)文件夹管理 (55)MOS软件界面图标 (56)第六章局限性和注意事项 (58)使用局限性 (58)警告和注意事项 (58)第七章危害及标志 (60)安全考虑和标志 (60)通用标志 (62)第八章设备维护 (63)维护频率 (63)维护清洗 (63)待机清洗 (65)关机步骤 (67)重启步骤 (68)所需磁盘空间 (68)杀毒软件 (68)第九章故障排除 (69)附件 (78)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 52020年12月Material # 20030132第一章概述产品名称中文名称：基因测序仪英文名称：MiSeq TM Dx Instrument型号：MiSeq TM Dx预期用途用于体外诊断。
MISEQ数据处理步骤
一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）1、下载Java：for64位。
2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。
Java-Xmx4g-jar..\rdp_classifier_2.6\dist\classifier.jarclassify-c0.8-ffi lterbyconf-h hier_output.txt–o samplename.classification.txt input.f asta注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。
手打指令，适用本机。
3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。
Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目Phylum:门Kingdom:界Species:种二、删除chloroplast（叶绿体）1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；2、找到后缀名为“H1.classification”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast（叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；4、新建“H1.accnos”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；5、打开程序“mothur”，输入：get.seqs(accnos=H1.accnos,fasta=H1.fasta)，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“H1.pick.fasta”。
MiSeq平台相关技术
MiSeq平台相关技术MiSeq平台简介MiSeq系统是Illumina公司推出的测序平台，测序原理和HiSeq基本相同，即基于DNA 单分子簇的边合成边测序技术和可逆终止化学反应原理。
其拥有不同测序读长模式，测序质量可与HiSeq相媲美。
性能参数如下截图所示。
图 1 MiSeq测序性能参数目前可以支持500-600bp的读长，堪与罗氏454平台读长媲美，但是通量却远高于454平台，2*250读长一个run可产出7-9G左右数据量，2*300读长一个run可产出12G左右数据。
MiSeq测序平台同时拥有较长的读长和较高的数据量产出的特点，是HiSeq和454都无法比拟的优势，是应用于分子生态和基因组测序的最佳平台。
相对于HiSeq系统，具有更长读长，可使拼装结果更加准确完整。
相对于454平台，高数据量产出，加大了测序深度和覆盖度，使测序得到的变异信息更加准确。
技术特点■读长及通量优势：读长优势可得到更准确拼装结果，通量高，PE250高达9G通量，PE300高达15G的通量；■样本制备便捷，试验周期短：最低50ng DNA模板，短时间几个小时的自动化操作就可以完成全部样品制备工作。
■最精确的测序原理: 沿用GA和HiSeq平台的边合成边测序的化学原理■最完整的整合功能:独立完成簇生成、双向测序及数据分析工作。
■数据产出均一性好:对每个样品的DNA量进行严格定量，提高了数据产出的均一性。
适用项目■宏基因组16S RDNA测序：美国Earth Microbiome Project已将该方法作为16S RDNA测序与环境群落结构多样性研究的标准方法，已有多名权威学者的研究成果在ISME J、Cell、Nature 和等顶尖期刊上发表。
■转录组测序：通过该平台测序可相对于Illumina HiSeq平台，可获得更长更准确的转录本拼装信息。
■微生物基因组（重）测序：Illumina MiSeq非常适用于对微生物基因组（重）测序，可得到更准确基因拼装结果的同时可大量准确检出SNP和indel信息。
Miseq操作流程及报价须知
一、最简单快速到建库方法Illumina为研究者提供了最简单快速到建库方法，使用Illumina Nextera转座子酶技术，在试管内即可完成DNA片段化，不需要物理剪切或者酶切步骤，一步完成DNA片段化，末端补平和加接头步骤，整个操作流程只需要90分钟，手动操作步骤不超过20分钟，起始DNA只需要50ng。
整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq提供了最简单的新一代测序流程。
通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID 追踪，具有自动化的便利。
小巧、一体化的Miseq平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。
整个簇生成和测序过程手动操作不超过20分钟。
经验证的数据质量以Illumina久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA链时检测它们。
由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。
最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。
文库构建：剪切，加接头二、整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq 提供了最简单的新一代测序流程。
通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID 追踪，具有自动化的便利。
小巧、一体化的Miseq 平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。
整个簇生成和测序过程手动操作不超过20 分钟。
三、经验证的数据质量以Illumina 久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA 链时检测它们。
由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP 都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。
miseq实验流程
2.1 MiSeq 测序实验流程2.1.1 基因组DNA 抽提默认用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit （D5625-01）进行样品提取。
完成基因组DNA 抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA ，用NanoDrop2000进行浓度的检测。
（具体参考多样性样品质检报告）一、 项目基本信息二、 样品检测方法● D NA 纯度检测方 NanoDrop2000 ● D N A 完整性、总量检三、 样品检测结果 N0. 美吉编号样品名称浓度（ng/μl ） OD 260/280OD 260/230项目名称 多样性 项目跟进销售 项目联系人 合同编号 收样员 收样日期 质检员 质检日期 报告撰写人 报告审核员 报告终审员报告日期胶图(取2μl样品跑胶)：2.1.2 PCR扩增按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。
为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1) 尽可能使用低循环数扩增；2) 保证每个样本扩增的循环数一致。
随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。
PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。
（具体参照PCR实验报告）PCR扩增报告1.项目基本信息2. PCR预实验2.1引物设计2.2 PCR扩增条件为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。
为了达到以上目的，我方首先随机选取10个样品进行预实验，以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。
seqMiSeq下的测序步骤DS故胺AI肽DoEarn等
seqMiSeq下的测序步骤DS故胺AI肽DoEarn等测序技术是一种分析DNA或RNA序列的方法，能够帮助研究人员了解生物体的基因信息和生物过程。
其中，seqMiSeq是一种常用的高通量测序技术，被广泛应用于生物学和医学领域。
在进行seqMiSeq测序时，有几个关键的步骤需要注意，包括DS故胺AI肽和DoEarn等。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
首先，我们来了解一下DS故胺AI肽的概念。
DS故胺AI肽（Dual-Indexed Adapter Primers）是一种测序接头引物，用于在测序前对DNA样品进行处理。
DS故胺AI肽主要有两个作用：一方面，它能够将引物与样品中的DNA分子连接起来，从而实现对DNA序列的扩增；另一方面，DS故胺AI肽还包含了用于标记和识别样品的测序索引序列。
通过引入DS故胺AI肽，我们可以同时测序多个样品，并将不同样品的测序数据进行区分和分析。
除了DS故胺AI肽，测序库的构建还需要用到AI肽（Adapter-Indexed Primers）。
AI肽是一种特殊的引物序列，能够与DS故胺AI肽中的索引序列相互匹配。
通过AI肽引物的作用，我们可以将DS故胺AI肽中连接的DNA序列进一步扩增和准备，在测序过程中提供足够的DNA模板。
在测序前的准备步骤中，DoEarn起着关键的作用。
DoEarn是一种DNA片段耦合反应，主要用来将引物和样品中的DNA序列连接起来。
通过DoEarn反应，我们可以将DS故胺AI肽和AI肽引物与DNA样品中的DNA序列连接起来，形成测序库。
在DoEarn反应中，需要注意的是反应温度、时间和酶的浓度等因素，以确保反应的效率和准确性。
完成了测序库的构建后，我们就可以进行seqMiSeq测序了。
seqMiSeq是一种高通量测序技术，通过短读长度和并行测序的方式，大幅度提高了测序的速度和效率。
在seqMiSeq测序中，测序仪会对构建好的测序库进行碱基的识别和记录。
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一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）
1、下载Java：for64位。
2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。
Java-Xmx4g-jar..\\dist\注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C 盘。
手打指令，适用本机。
3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。
Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目
Phylum:门Kingdom:界Species:种
二、删除chloroplast（叶绿体）
1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；
2、找到后缀名为“”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel 打开；
3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast（叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；
4、新建“”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索
选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；
5、打开程序“mothur”，输入：(accnos=,fasta=，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“。
三、多个样本时的序列深度归一化处理
1、经过步骤一、二处理后，以各样本的“*.”为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件；
2、用Excel打开“txt”文件，记录各个样本的“Totalreads”；以最小的“Totalreads”为基准，进行多个样本的序列深度归一化处理；
3、打开程序“mothur”，输入：
(fasta=式中，*即为最小的“Totalreads”数。
系统会自动生成一个新的fasta文件“。
4、以新的fasta文件为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件，对“txt”文件进行整理，进行后续分析。
四、热图
1、数据预处理：将原始相对丰度数据取自然对数（lg），对于丰度为0的物种，人为输入经自然对数处理后的下限值；
2、保存数据为CSV文件，拷贝至R文件夹“h:/Software/R/”；（注意数据呈现方式，是否需要转置）
注意：物种和实验组名称不得出现“—”和空格，以下划线“_”代替。
2、按教程操作（蓝白配图命令）。
pheatmap(hm[1:m,]),col=colorRampPalette(c("white","blue"))(n=1 00),=1,scale="row",key=TRUE,symkey=FALSE,="none",trace="no ne")
如果想颜色与取了自然对数（lg）后的数据相匹配，则将上面的命令中scale="none"，即可。