分子生态学分子标记
分子标记与遗传图谱
分子标记与遗传图谱AFLP的原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。
限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。
选择特定的片段进行PCR扩增，由于在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3’端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3’端严格配对的片段才能得到扩增。
再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
该技术包括三个步骤： DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头 adapter 连接；利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。
利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。
由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA 谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生；这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记；所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
简单序列长度多态性 Simple Sequence Length Polymorphisms,SSLP 限制性片断长度或PCR产物长度因为小卫星或微卫星随机重复数量的变化形成的差异。
SSLP具有多等位性，有两种SSLP常用于作图：小卫星序列：又称可变串联重复，其重复单位为数十个核苷酸。
微卫星序列：或简单重复序列，其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。
微卫星序列的应用比小卫星序列的应用普遍的多，原因有二：小卫星序列大多集中在染色体的端部；而微卫星序列在整个基因组中分布广密度高；微卫星序列PCR分析：PCR扩增的DNA长度少于300bp时，反应既快速又精确。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
dna分子标记技术概述
dna分子标记技术概述DNA分子标记技术是一种基于DNA序列的分析方法，可以用来研究生物体的遗传变异和基因表达。
它是现代分子生物学和遗传学研究的重要工具之一，被广泛应用于农业、医学、生态学等领域。
DNA分子标记技术的基本原理是利用DNA序列的差异性，通过特定的方法将其转化为可检测的标记，然后利用这些标记来分析不同生物体之间的遗传关系和基因表达差异。
常用的DNA分子标记技术包括PCR-RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等。
PCR-RFLP是一种利用PCR扩增DNA片段后，通过酶切鉴定其长度差异的方法。
RAPD是一种利用随机引物扩增DNA片段后，通过其长度和数量的差异来分析不同生物体之间的遗传关系的方法。
AFLP是一种利用限制性内切酶和连接酶对DNA片段进行特异性扩增的方法。
SSR是一种利用特定的引物扩增含有重复序列的DNA片段的方法。
SNP是一种利用单核苷酸多态性来分析不同生物体之间的遗传关系和基因表达差异的方法。
DNA分子标记技术具有高度的灵敏性、准确性和可重复性，可以用来研究不同生物体之间的遗传关系、基因表达差异、基因型鉴定等问题。
它在农业领域的应用主要包括品种鉴定、遗传多样性分析、杂交种育种等方面。
在医学领域，DNA分子标记技术可以用来研究遗传疾病的发生机制、基因诊断、药物反应等问题。
在生态学领域，DNA分子标记技术可以用来研究物种多样性、种群遗传结构、生态系统功能等问题。
总之，DNA分子标记技术是一种重要的分子生物学和遗传学研究工具，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，它将在更多领域发挥重要作用，为人类的生产和生活带来更多的福利。
生态学实验技术第三讲 分子生态学实验方法与技术
分子生态学的研究方法
主要包括两大类：
基于DNA层次的研究方法和基于蛋白质层次的研究方 法。
DNA层次的主要研究对象是线粒体DNA、叶绿体 DNA、核糖体DNA、基因组DNA；
• 蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。
有些酶(如ACP、EST、PER等)的结构尚不清楚。这些酶系 统的位点数目很多，酶谱相当复杂，酶谱的解释如无可靠的遗传 分析为基础，会产生多种可能的解释，其结果往往不可靠。
3 电泳胶的制备
酶电泳的介质有多种，最常用：淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。 与聚丙烯酰胺比较，淀粉无毒，且显色效果和聚丙烯酰胺胶
酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反 映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编 码DNA 顺序上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需 的遗传信息。
在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。 等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同 一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反 映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重 要遗传标记。
分子标记的种类与历史
蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来 核苷酸序列和片段：tRNA（1965） • 1980年以来：RFLP(限制性片段长度多态） • 1984年以来：SSR(短重复序列标记) • 1990年以来：RAPD(随机扩增长度多态) • 1993年以来：AFLP(扩增片段长度多态)
一 等位酶技术
基本过程包括：
DNA提取、限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、基因构 建、DNA测序或指纹谱带测定。
目前，常用分子标记技术包括:
《分子标记的应用》课件
通过检测犯罪现场遗留的生物样本中的分子标记，为犯罪调查提供 证据和线索。
遗传疾病研究
利用分子标记研究遗传性疾病的发病机制和家族遗传规律，为法医学 中的遗传疾病分析提供支持。
THANKS
分子标记技术的种类
01
限制性片段长度多态性（RFLP）
利用限制性内切酶切割基因组DNA，产生不同长度的片段，再通过电
泳和 Southern 杂交技术检测多态性。
02
微卫星标记
利用串联重复的DNA序列在不同个体间的变异来标记基因组，具有高
度多态性和遗传稳定性。
03
单核苷酸多态性（SNP）
检测单个核苷酸位点的变异，是最常见和应用最广泛的分子标记之一。
通过分子标记技术，可以鉴定 家禽品种间的遗传差异，为品
种选育提供依据。
分子标记还可以用于研究家禽 繁殖和生长等重要经济性状的 遗传基础，为育种提供理论支
持。
通过分子标记辅助选择，可以 快速准确地选择具有优良性状 的个体，提高家禽生产效益。
分子标记在兽医学中的应用
分子标记在兽医学中主要用于动物疾病诊断、抗病育种 和药物研发等方面。
利用分子标记技术快速筛选具有潜在活性的药物候选物，提高药 物研发效率。
药物靶点发现
通过研究分子标记与药物反应的关系，发现新的药物作用靶点， 为新药研发提供方向。
药物疗效评估
利用分子标记监测药物治疗过程中的生物标志物变化，评估药物 疗效和安全性。
分子标记在法医学中的应用
身份鉴定
利用DNA分子标记进行个体身份鉴定，在法医鉴定、亲子鉴定等领 域具有重要应用。
种群遗传多样性分析
分子标记可以揭示种群内的遗传变异，了解种群的遗传结构、变 异水平和进化历史。
ISSR分子标记法
1、基因组DNA的提取，这个可以用试剂盒或者是传统的CTAB法，提取后的DNA经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观测提取DNA的质量2、选取ISSR引物，并请生物公司合成3、利用合成的引物，和自己提取的DNA，进行PCR扩增4、ISSR最关键的便是PCR的扩增过程，在此过程中还要进行体系的优化、退火温度的筛选等，如果这些都可以了，便已经完成了整个实验的99%5、进行数据的分析ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。
其基本原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。
所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。
ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低。
与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。
目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。
ISSR标记ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
分子生态学复习资料汇总
分子生态学名词解释等位酶：（Allozyme）同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式。
突变：Genic mutation：基因突交是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。
从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
替换：即一种核苷酸被另一种核苷酸所取代。
•碱基替换有两种类型：转换是发生在嘌呤之间(A和G)或密啶之间(C和T）的变换;颠换则指嘌呤和嘧啶的变换。
•转换比颠换更频繁。
PCR：（聚合酶链式反应）在生物体外，利用一小段DNA作为模板，在DNA聚合酶的作用下，将材料dNTPs复制成跟模板互补的DNA链。
PCR每个循环可分为三步：DNA变性、引物退火、新合成序列的延伸。
单亲遗传( uniparental inheritance):基因和遗传因子仅遗传自一个亲本。
该术语最常用于描述线粒体和质体基因组的遗传（包括叶绿体基因组cpDNA）,以及有性繁殖生物中一些性染色体的遗传。
双亲遗传( biparental inheritance):基因与遗传因子遗传自两个亲本;仅适用于有性繁殖生物。
共显性标记：( co-dominant markers)可以区分杂合子与纯合子的分子标记。
显性标记:( dominant markers)难以区分纯合与杂合个体的分子标记。
限制性片段长度多态性（RFLP）：一种显性分子标记技术,用一种或多种限制性内切酶,对整个基因组或预选的DNA片段进行消化,从而生成多条DNA 片段。
所获得的带型取决于相应的DNA序列的变异水平,因为每一个体中DNA序列的变异会影响限制性酶切位点的数量。
单核苷酸多态：( single nucleotide polymorphism, SNP )由单核苷酸替换所导致的两条DNA序列间的一个变异。
微卫星(microsatellite)：一种DNA片段，由短的串联序列组成,通常以不超过5个碱基对的单元重复多次，如:在(AG)，代表的微卫星片段中,序列AG重复了10 次。
微生物的分类方法
微生物的分类方法微生物是指肉眼无法看到的微小生物，主要包括原核生物和真核生物两大类。
原核生物主要包括细菌和蓝藻，真核生物则包括真菌、原生动物和微藻等。
对于微生物的分类，科学家们采用了多种方法，其中最常用的是基于形态学、生理学、生态学和分子生物学的分类方法。
下面将介绍这些分类方法的主要内容。
1.形态学分类：这是最早也是最基础的分类方法，主要根据微生物的形态特征进行分类。
例如，根据细菌的形状，可以将其分为球形细菌（如链球菌）、杆状细菌（如大肠杆菌）和螺旋细菌（如梅毒螺旋体）等。
此外，还可以根据真核微生物的细胞结构和生殖特征进行分类。
3.生态学分类：这种分类方法是根据微生物在自然界中的生活习性和分布情况进行分类。
例如，根据微生物生活的环境，可以将其分为土壤微生物（如放线菌）、水体微生物（如蓝藻）和肠道微生物（如乳酸菌）等。
此外，还可以根据微生物在生态系统中的作用，将其分为分解者、产生者和共生微生物等。
4.分子生物学分类：这种分类方法是根据微生物的基因组序列和分子结构进行分类。
利用分子生物学技术，可以通过测定微生物的DNA序列，比较不同微生物之间的遗传关系和相似性，从而将其分类到不同的系统发生树分支上。
此外，还可以利用分子标记的方法，如PCR和基因测序，快速鉴定微生物的种类。
除了以上分类方法外，还有一些更细致和专业的分类方法，比如对特定微生物群体进行研究的分类方法。
例如，对细菌进行分类可以使用质谱分析技术，对真菌进行分类可以使用菌株的生长特性和生殖结构等特征。
总的来说，微生物的分类方法是一个不断发展和完善的过程。
随着技术的进步和对微生物世界的深入了解，我们对微生物的分类将更加准确和精细，为微生物相关领域的研究和应用提供更好的支持。
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（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜， 成本较低；
（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
（二）AFLP标记 • Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)
AFLP标记是扩增片段长度多态性的简称 是RFLP与PCR两项技术相结合的产物，AFLP技 术的主要步骤： DNA提取 有两种限制性内切酶酶切DNA 寡聚核苷酸接头的连接 对限制性酶切片段的 选择性扩增 扩增产物的电泳分析。由于不同
必都能表达在酶谱上; 3.大量的新鲜的活体素构造表示活体取样可 能遇到困难; 4.可能有非遗传性的或人为的带干扰酶谱解释; 5. 同 一个体不同器官或不同发育时期酶的活性有时可能不一样。
同工酶与等位酶
推荐读物
• 王中仁.1996.植物等位酶分析.北京：科学 出版社
DNA分子标记
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经 发展了很多种：
•
过氧化物酶、脂酶、磷酸酶和肽酶等，其同工酶的数量、位置和四
级结构往往是可变的，虽然它们也常常也被用来检查遗传变异性，但这
些酶对种群遗传结构和系统发育的分析可能是无用的，因为它们的同源
性往往不能肯定。
二倍体的基因型与酶型的关系
等位酶分析的应用
• 1. 了解自然种群的遗传结构; • 2. 探查种群的交配系统和交配类型; • 3. 探查种群间的分化程度; • 4. 交系分析; • 5. 分子生态学其它应用.
英文缩 写
RFLP
STS RAPD
AFLP
SSR SNP
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文名称
中文名称
Restriction fragment Iength polymorphism
Sequence tagged site
限制性片段长度多 态性
序列标签位点
R andom amplified polymorPhic DNA
来编码的同工酶，即造成同种酶多种分子形式的原因在于编码它
们的是同一位点上不同的等位基因。这类特殊的同工酶叫做等位
基因同工酶（allele isozyme），简称等位酶(allozyme)。利用同工
酶变异作为基因组变异的指标.
•
同工酶与等位酶
等位酶分析的过程
材料的采集
研磨和酶的提取
酶的保存
淀粉凝胶制备
Amplified frangment length Polymorphism
Simple sequence repeat
随机扩增多态性 DNA
扩增片断长度多态 性
简单序列重复
Simple mucleotide polymorphism
单核苷酸多态性
几种主要的DNA分子标记
（二）RFLP标记：称为限制性片段长度多 态性，是指用某一种限制性内切酶来切 割来自不同个体的DNA分子上，内切酶 的识别序列有差异，即是由限制性酶切 位点上碱基的插入、缺失、重排或点突 变所引起的。这种差异反映在酶切片段 的长度和数目上。
（1）是以Southern杂交技术为核心的分子标记， （如RFLP），这类分子标记被称为第一代分 子标记。
（2）是以PCR技术为核心的分子标记，（如 STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标 记被称为第二代分子标记；单核苷酸多态性 （SNP）标记被称为第三代分子标记 。它也是 以PCR技术为基础的分子标记技术。
电泳
凝胶切片
酶的组织化学染色
数据分析
酶谱的记录与分析
同工酶与等位酶
酶谱照片——二倍体
同工酶与等位酶
酶谱照片——多倍体
同工酶的遗传学分析
•
1 酶蛋白的结构 我们常选来作遗传分析的酶都是单体酶、二聚
体酶或四聚体酶。因为它们的酶谱比较少，容易分析。对大多数酶的遗 传学控制已了解得相当清楚，所以这就允许我们从凝胶上的带谱作出遗 传学的推断。
分子生态学
• 参考书:
• 1..《Molecular Ecology 》(Second Edition) ( Freeland J. R., Kirk H. and
Petersen S.), 2011, Wiley-Blackwell.
• 2. 《分子生态学》(Bee T.J.C., Rowe G.)(张军丽等译），中山大学出版社， 2009。
等位酶分析方法的优缺点
• 优点： • 1. 等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律,便于遗传学分析; • 2. 量化, 可实验,可重复; 3. 不容易饰变; • 4. 取材和样品制备简单易行; 5. 结果明解,可比性强. • 缺点: • 1. 有限种类的酶分析会带来一定的偏差; 2. 所先酶的所有基因未
• 3.《生物多样性译丛（三）》
•
中国科学院生物多样性委员会。科学出版社，1997
• 4《植物分子生态学》
•
阮成江，何祯祥，周长芳。化学工业出版社，2005
同工酶
•
1. 同功酶（Isozyme）: 是指同一种酶的多种分子形式，这些
不同的分子形式具有相同或相似的底物，催化相同的反应。
•
2. 等位酶（Allozyme）：由同一基因位点上受不同等位基因
B RFLP标记在等位基因之间是共显性的， 因此在配制杂交组合时不受杂交方式的 影响。
C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位 效应，因而互不干扰
D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变 异，在数量上几乎不受限制
E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以 用于大规模的育种实践中。在植物分子 标记辅助育种中需要将RFLP转换成以 PCR为基础的标记。
RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
RFLP技术主要包括以下基本步骤：
DNA提取
用限制性内切酶酶切DNA 、
用凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段
转移到滤膜上 利用放射性标记的探针杂交
显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果
分析。
• 特点
A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环 境条件和发育阶段的影响。
RAPD
Hale Waihona Puke （三）RAPD标记 RAPD标记的基本原理是利用合成的随机引物 （一般为10个碱基）对基困组DNA进行PCR扩 增 ，然后电泳检测PCR产物的多态性。
RAPD标记的主要特点有：
（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道 序列信息；
（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴 别杂合子和纯合子；