微生物蛋白提取和分离纯化

菌体
膜系结构：周质蛋白，膜蛋白
微生物蛋白提取和分离纯化
细胞破碎和蛋白质溶解
微生物蛋白提取和分离纯化
• 机械法 匀浆、研磨、压榨、超声等
• 非机械法 渗透、酶溶、冻融、化学等
• 新方法 激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等
微生物蛋白提取和分离纯化
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微生物蛋白提取和分离纯化
微生物蛋白提取和分离纯化
– 一般来说，pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响 较大，如对于弱酸酸型离子交换剂在pH较高时， 电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的 pH时，电荷基团不易解离，交换容量小；同时 pH也影响样品组分的带电性。
– 离子强度增大，交换容量则下降。实验中增大 离子强度进行洗脱，就是要通过降低交换容量 把结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下Biblioteka Baidu。
–水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， –酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， –脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。
• (3)粗提: 用离心法除去固体杂质后，可通过沉淀 法、膜分离法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制 品。
• (4)精制：可用层析法、电泳法进行精制。 • (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。
微生物蛋白提取和分离纯化
微生物中蛋白的分离纯化
微生物蛋白提取和分离纯化
用途: • 药物——多肽
• 饲料——菌蛋白
• 工业——酶
按其所发挥的功能把小肽分为两大类,即 功能性小肽和营养性小肽。功能性小肽指
能参与调节动物的某些生理活动或具有某
单细些胞特蛋殊白作具用有的较小门肽的,如营抗养菌价肽值、。免茵疫体肽中、 蛋白抗质氧可化达肽4、0、激6素0肽％、，表其皮中生氨长基因酸子组等份。齐营 目前全，，养生生性物物小界效肽已价是发较指现高不的，具酶相有有当特数于殊千酪生种蛋理，白调用，节微为功生7能0物, 发 酵法左生右只产，为的而蛋酶且白有赖质上氨合百酸成种等提。必供工需氮业氨架化基的生酸小产含肽的量。酶较制高剂，， 按用还途具不有同丰可富分的为维工生业素用，酶可和以医作药为用维酶生两案大的类， 前者补一给般品不。需纯制品，而后者要求的纯度较高， 其价格是前者的数千倍至数百万倍。由微生物生
➢分辨率较高：优化操作条件可大幅度提高分 离的选择性；所需柱长较短可在较高流速下 操作；
➢吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品 回收率高；
➢离子交换剂种类多，选样余地大，价格也远 低于亲和吸附剂。
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• 层析条件——离子强度、pH值 、流速等。 主要影响样品中组分和离子交换剂的带电 性质。
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胞外酶
• 取预处理后的上清液（滤液），根据目的 蛋白的相关性质，采用相关的方法提取纯 化目的蛋白。
溶于醋酸缓冲液中 10000rpm冷冻离心
收集上清
DEAE-Sepharose FF层析 调节pH至5.6 CM一Sephaorse FF层析
(（中等碱性）阴离子交换树脂)
（（弱酸性）阳离子交换树脂）
透析后浓缩
Supedrex一75层析 （分子筛柱）
酶活检测
SDS-PAGE电泳
Sephaery1S一200HR层析
• 根据所需的目的蛋白制定蛋白提取和纯化 的策略和步骤
• 一般的预处理：过滤（工业生产）和离心 （实验室研究）
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下， 将离悬心浮分液离中是的利固用体转粒鼓子高截速留转，动而所与产液生体的分离离心的力技，术。 来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的目的。
根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤（适合固体含量<0.1g/100ml、 颗粒直径5~100µm ）和滤饼过滤（适合固体含量>0.1g/100ml ）两种。 根据离心原理，离心分离方法可分为：差速离心法,密度梯度离心法。 差速离心法分别率不高，常用于常用于其他分离方法之前的粗制品
• 举例： 壳聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件的优化
及壳聚糖酶的分离纯化
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粗酶液
加入50%PEG6000 至终浓度为5%
4000rpm离心
4℃静置2h
取上清，-20℃ 预冻15min
加入等体积-20℃的丙酮
混匀，-20℃静置2h 4000rpm离心
取沉淀
加入少量乙醚
4℃真空干燥
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层析过程
– （1）装柱 – （2）平衡（equilibrium) – （3）上样(loading) – （4）洗涤(washing) – （5）洗脱(elution) – （6）清洗与再生
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离子交换柱特点
➢料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离 过程具有浓缩作用；
提过取滤和设细备胞：器板的分框离过。滤若机要，保真持空目转的鼓蛋白过保滤持机活，性错，流则过需滤要，进行硅低藻温土冷过冻滤离机心。
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预处理
菌体表达的胞外酶
上清（滤液）
菌体表达的胞外酶分解培养基形成的小肽 及一些氨基酸成分
未分解利用的部分培养基
沉淀（滤饼）
胞内匀浆：胞内表达的酶，小肽
产的工业用酶制剂主要有糖化酶、淀粉酶、转化
酶、异构酶、半乳糖酶、纤维素酶、蛋白酶等，
医药用酶主要有蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、
核酸酶、脂肪酶、尿激酶、链檄酶、天冬酰胶酶
超氧化物歧化酶、溶菌酶、血溶栓酶等等
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蛋白质的分离纯化步骤
• (1)生物组织的机械破碎。
• (2)抽提：根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进 行抽提。
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离子交换柱层洗析脱液的的流速操也会作影响要离子点交换层析 分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。
• 1.平衡缓冲液
一般洗脱速度慢比快的分辨率要好， 但洗脱速度过慢会造成分离时间长、
• 2.上样
样品扩散、谱峰变宽等副作用，所以 要根据实际情况选择合适的洗脱速度。
• 3.洗脱缓冲液要保证各个待如分果离洗物脱质峰（相如对蛋集白中质某）个的区稳域定造；成要重使各 个待分离物首质先叠与要，离保则子证应交在适换整当剂个缩有洗小适脱梯当液度的梯范结度围合范或，围降并内低尽，洗量使