单向琼脂扩散试验.
单向琼脂扩散实验报告
单向琼脂扩散实验报告单向琼脂扩散实验报告琼脂扩散是一种常用的生物化学实验方法，用于研究溶质在凝胶中的扩散行为。
本次实验旨在通过单向琼脂扩散实验，探究不同溶质在琼脂凝胶中的扩散速率差异，并分析影响扩散速率的因素。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 琼脂凝胶：用于扩散实验的基质，提供扩散通道。
- 溶质：本实验选取了葡萄糖、盐和蛋白质作为溶质，代表了不同分子大小和电荷性质。
- 染料：用于标记扩散的溶质，便于观察和测量。
- 实验仪器：包括扩散装置、显微镜、图像处理软件等。
2. 实验方法：- 准备琼脂凝胶：按照实验要求，制备一定浓度的琼脂凝胶，并将其倒入扩散装置中。
- 加入溶质：将溶质溶解在适量的溶剂中，然后滴加到琼脂凝胶的一侧。
- 观察扩散过程：使用显微镜观察溶质在琼脂凝胶中的扩散情况，并记录下扩散的时间和距离。
- 数据处理：利用图像处理软件对实验结果进行分析，计算扩散速率和扩散系数。
实验结果与讨论：通过实验观察和数据处理，我们得到了不同溶质在琼脂凝胶中的扩散速率。
结果显示，葡萄糖的扩散速率最快，盐次之，蛋白质最慢。
这一结果与我们的预期相符，因为葡萄糖是小分子溶质，能够更容易地在琼脂凝胶中扩散，而蛋白质由于其较大的分子大小和复杂的结构，扩散速率较慢。
除了分子大小外，溶质的电荷性质也对扩散速率产生了影响。
我们观察到带正电荷的盐离子扩散速率较快，而带负电荷的蛋白质扩散速率较慢。
这可能是由于凝胶中的电荷相互作用导致的。
带正电荷的盐离子与凝胶中的负电荷结合较弱，因此能够更容易地扩散。
而带负电荷的蛋白质由于与凝胶中的正电荷相互作用较强，扩散速率较慢。
此外，扩散速率还受到温度的影响。
在实验中，我们分别在室温和冰箱温度下进行了实验，发现在较高温度下，溶质的扩散速率更快。
这是因为在较高温度下，分子的热运动更剧烈，扩散速率也随之增加。
综上所述，通过单向琼脂扩散实验，我们研究了不同溶质在琼脂凝胶中的扩散行为，并分析了影响扩散速率的因素。
《医学免疫学与微生物学》实验报告
［实验名称］:沉淀反应 ［实验目的］:通过单向琼脂扩散测定待测血清Ig 含量［实验材料］: 打孔器(1)将溶解后的离子琼脂冷却到4 5 °C ，加入适当浓度的抗原混 合均匀，吸取3—4毫升加在载玻片上，使其均匀布满载玻片 而又不流失。
(2) 琼脂凝固后制成凝胶板，然后隔适当距离打孔。
(3) 在孔内滴加待测可溶性抗体。
(4) 将凝胶平板放入带盖瓷盘中，下面垫一湿纱布以保持湿度，置 于37 °0恒温箱中2 4小时，观察沉淀环。
单向琼脂扩散是一种定量试验，主要用来测定标本中各种免疫球蛋白或补体成分的含量。
在孔中加入待测抗体使其向四周扩散，经一定时间后抗体与琼脂中抗原相遇，在比例适宜处生成白色沉淀环。
沉淀环直径与抗体浓度成正比。
根据测试样品沉淀环直径的大小，可从已知的标准曲线中查出样品中抗体的含量。
实验二［实验名称］:间接凝集抑制试验（妊娠试验）［实验目的］:测定待检尿液中是否含HCG （绒毛膜促性腺激素）以诊断妊娠［实验材料］:孕妇尿液、非孕妇尿液、HCG 致敏乳胶抗原、抗HCG 血清、载实验一1%离子琼脂、白喉类毒素、白喉抗毒素、载玻片、毛细吸管［试验步骤］: ［实验结果］: (沉淀环直径) 测量沉淀环直径:毫米［实验分析］玻片等［试验步骤］:（1）取一片载玻片，标记出左右。
（2）在载玻片左侧加一滴待检尿液，右侧加一滴非孕妇尿液。
（3）在两侧尿液中分别加一滴抗HCG血清，摇动混匀2 —3分钟。
（4）在两侧液滴中分别再加一滴HCG致敏乳胶抗原，摇动混匀2 — 3分钟。
（5）观察判定结果。
［实验结果］:（凝集和非凝集的描述）左侧（待检尿液侧）呈现均匀的乳状液状态，无凝集颗粒。
间接凝集抑制阳性。
右测（非孕妇尿液侧）出现明显的凝集颗粒。
间接凝集抑制阴性。
［实验分析］:（结合实验原理）孕妇尿液中的HCG含量显著增高。
尿液中的HCG与加入的抗HCG结合, 抗HCG被消耗，使得加入的HCG乳胶抗原不能再与抗HCG结合，不出现乳胶抗原间接凝集反应（凝集被抑制），所以液滴呈现均匀乳状液，为乳胶间接凝集抑制阳性反应。
免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测—单向琼脂扩散法
免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测—单向琼脂扩散法
【申请单】请完成申请单所要求项目
×××市人民医院检验申请单
姓名
性别年龄
门诊号住院号
诊断或症状
检验标本
检验目的
送检科室医师
送检日期年月日
【方法选择】
表13-2 免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测
方法单向琼脂扩散法火箭免疫电泳速率散射比浊法ELISA 放射免疫分析法本次检查选择√
以检测待检人血清IgG为例。
【材料准备】
1.抗原：待检人血清、IgG免疫球蛋白工作标准品（IgG含量为10mg/ml）。
2.抗体：羊抗人IgG抗血清（单扩效价1：100）。
琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3，载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸耳球、三角烧瓶、湿盒、水浴箱、温箱、半对数坐标纸。
【操作方法】
将1.0%～1.5%琼脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成）加热溶化，加0.01%（0.1g/L）NaN3，置于56℃水浴中备用。
吸取99ml已经融化的琼脂于三角烧瓶中，置于56℃水浴中，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。
单向双向免疫琼脂扩散
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上， 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
（一）标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件 （适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
＋
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
医学免疫学实验： 琼脂免疫扩散实验
第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。
二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。
2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。
3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。
当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。
四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。
（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。
稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。
单向琼脂扩散试验.
实验三、单向琼脂扩散试验一、实验原理该实验是定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻璃板，凝固后，在琼脂层中打孔，再将可溶性抗原加入孔中。
孔中抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处，出现白色沉淀环，沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
二、实验目的熟练掌握单向琼扩检测技术三、实验材料1．诊断血清：羊抗兔血清2．待测血清：兔血清3．阴性对照血清4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
四、实验方法1．取一干净培养皿，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。
孔的排列方式如图1所示。
图1 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。
若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。
实验时至少要做一阳性对照。
出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。
6．结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。
①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。
反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。
见图2。
图2 双扩散试验结果示意图A：已知抗体a、b：阳性对照c、d、e、f：被检材料②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。
见图3。
图3 抗原特异性与沉淀线形状的关系a、b：抗体A、A’、B：抗原A、B完全不同A、A’部分相同③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。
通常反应在0-37℃下进行。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳(Single Immunodiffusion and
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（Single Immunodiffusion and可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。
即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(floccu lation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek 氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。
本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。
（一）单向免疫扩散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG 正常值测定一、基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM 的水平。
二、实验材料2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。
标准马抗人IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）pH7.2 PBS.打孔器（孔径3mm）及打孔模板微量加样器湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）已制备好的含有1%马抗人IgG 抗体的琼脂板1/50 稀释的单人份待检血清标本三、实验方法（一）标准曲线的制备：1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。
琼脂扩散实验原理
琼脂扩散实验原理一、琼脂扩散实验的基本过程1、实验目的掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。
2、材料与试剂传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。
3、实验步骤（1）．预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
（2）．凝胶板的制备溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。
梅花型：（3）．免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。
待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。
湿盒于25℃中，一般保温2 4～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。
免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。
4、标本的保存为了保存标本，可染色处理，步骤如下：（1）用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。
（2）浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。
（3）打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。
（4）用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。
也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。
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①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图2。
图2双扩散试验结果示意图
A：已知抗体a、b：阳性对照
c、d、e、f：被检材料
②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图3。
图3抗原特异性与沉淀线形状的关系
a、b：抗体A、A’、B：抗原
A、B完全不同A、A’部分相同
③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
2．待测血清：兔血清
3．阴性对照血清
4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
四、实验方法
1．取一干净培养皿，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔Fra bibliotek，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图1所示。
图1双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。
⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。
4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。
实验三、单向琼脂扩散试验
一、实验原理
该实验是定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻璃板，凝固后，在琼脂层中打孔，再将可溶性抗原加入孔中。孔中抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处，出现白色沉淀环，沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
二、实验目的
熟练掌握单向琼扩检测技术
三、实验材料
1．诊断血清：羊抗兔血清