紫外可见分光光度法测定维生素B12含量
紫外可见分光光度计维生素B12含量测定
三、仪器组成
紫外 - 可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器 四部分组成。
1、光源
对光源基本要求：足够光强、稳定、 连续辐射且强度随波长变化小。
（1） 钨及碘钨灯： 340～2500 nm ，多 用在可见光区；
（2） 氢灯和氘灯： 160～375nm ，多用 在紫外区。
2、单色器 (Mnochromator)
与原子吸收光度仪不同，在 紫外 可见分光光度计中，单色器通常置于 吸收池的前面！
(可防止强光照射引起吸收池中一 些物质的分解)
单色器： 是分光光度计的关键部件，主要任务是将光源发来的混
合光分解为单色光，并提供所需波长的光。
3、吸收池 (Cell ， Container) ：
用于盛放样品。可用石英或玻璃两 种材料制作，前者适于紫外区和可见光 区；后者只适于可见光区。有些透明有 机玻璃管 光电倍增管
四、实验仪器与试剂
1、仪器： UV-2501型紫外-可见分光光度计（Simazu
公司）；1cm 石英比色皿
2、试剂： 维生素B12注射液：100mg/ml
五、试剂配制与测定
1、 配制标准系列：取维生素B12标准溶液100mg/mL 0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL分别置 于50.00mL 容量瓶中，用水稀释至刻度；
八、思考题：
为什么同浓度溶液，每次测量后读数会发生 细微变化？
紫外分光光度法与可见分光光度法有些什么 区别？
六、仪器安装环境
七、仪器使用注意事项：
仪器操作过程出现异常情况，不得私自关闭电源，需由教师指 导完成。
实验室内不准来回跑动。 不准随意搬动仪器。 在测量状态下，不得将手伸入测量室内，以防紫外线灼伤！ 不准私自调整实验室空调的设定温度及风速。 同学操作时请注意爱护仪器，如有人为损坏需照价赔偿。
紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量
实验四 紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量一、实验目的1、理解紫外—可见分光光度法定性分析、定星分析的原理。
2、掌握紫外—可见分光光度法测定维生素B12含量的原理。
3、掌握UV—7502PC紫外—可见分光光度计的结构、原理与操作。
二、原理分子中的电子发生跃迁需要的能量约在1~20eV之间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱或紫外—可见吸收光谱。
物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律，即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。
在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。
1. 紫外-可见分光光度计的基本结构紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录系统组成。
图1 紫外—可见分光光度计基本结构图2.透光率和吸光度如图2所示：入射光强度I0，吸收光强度I a，透过光强度I t， 反射光强度为I r I0═ I a + I t + I r被测溶液和参比的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═ I a + I t透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；反之，透光率愈小，溶液对光的吸收愈多透光率的负对数称为吸光度，用符号A 表示。
紫外分光光度法测定维生素B12注射液含量的不确定度分析
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紫外分光 光度法具有操作简便 、 应性广 、 速等优 点 ， 适 快
ｅ ｔｂｌｓ ｅ ｔ ｅ ｔｃ ｌｍｏ ｅ ｆｕ ｃ ｒａｎ ｙ ｍｅ ｓ ｒ ｍｅ ｔｗａ ｅ ｓ ｎａ ｌ ｎｄ ｒ ｌａ ｌ ｒｔ ｅ ｕｎ ｅｔ ｉ ｔ ｖ ｕａｉ ｎ ｏ ｔ ｎ ｓａ ｉｈ ｄ ｍａ ｈ ｍａ ｉａ ｄ ｌｏ ｎ ｅ ｔ ｉｔ ａ ｕ ｅ ｎ ｓ ｒ ａ ｏ ｂｅ ａ ｅ ｉｂ ｅ ｆ ｈ ｃ ｒａ ｎｙ ｅ ａ ｔｏ ｆＶｉ ｏ ｌ ａｍｉ
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实践四、维生素B12的含量测定
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三、实验原理
结构特点：含钴的卟啉类化合物 临床用途：控制恶性贫血 性状：红色晶体物质
在361nm有最大吸收。 可以采用紫外分光光度法测 定含量。
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三、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ验原理
吸光系数法
1、配制待测溶液，计算配制浓度的百分浓度Cx；
2、以溶剂作为空白参比，测定待测溶液的吸光度Ax；
3
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数据处理
E = 1% 1cm（样）
Ax Cxl
=
Ax 0.0025 1
%
EE1111cc%%mm（ （样 标） ）100%=
E1% 1cm（样） 207
=
Ax
100%
0.0025 207
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3、计算待测溶液的吸收系数
E = 1% 1cm（样品）
Ax Cx
4、计算含量
w%
E1% 1cm（样品）
E1% 1cm（标准）
已知E11c%m（标）=207
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四、实践步骤
• 1、维生素B12样品溶液的配制：
准备0.5mg/ml 注射液
取5.00ml
定容至100ml
C样
0.5mg/ml 5.00ml 100.00ml
=0.0025g/100ml
• 2、以纯化水为参比，测定样品溶液的吸光度
• 3、计算样品含量
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四、实践步骤
• 3、计算样品含量
E = 1% 1cm（样）
Ax Cxl
=
Ax 0.0025 1
%
EE1111cc%%mm（ （样 标） ）100%=
紫外分光光度法测定维生素B12注射液含量的不确定度分析
紫外分光光度法测定维生素B12注射液含量的不确定度分析秦立;陈诗慧;范亚刚【期刊名称】《云南中医学院学报》【年(卷),期】2013(000)006【摘要】Objective To evaluate the measurement uncertainty for the content determination of Vitamin B12 injection by UV. Methods The model of content determination by UV was established. The uncertainty sources had been analyzed. Each active component of uncertainty was calculated,and the extended uncertainty was obtained. Results The extended uncertainty for the UV determination of Vitamin B12 was1.0%,the result of content d etermination was(98. 4±1. 0)%,k=2. Conclusion The main sources of uncertainty were analyzed,which provided a reliable theoretical basis for effectively controlling of this method.%目的：分析UV 法测定维生素B12注射液含量的测量不确定度。
方法建立UV法测定含量的数学模型，分析测量不确定度的来源并对各分量进行量化分析和评估，合成标准测量不确定度，给出扩展测量不确定度报告。
结果 UV法测定维生素B12注射液含量的扩展测量不确定度为1.0%，测量结果表示为（98.4±1.0）%，k=2。
维生素B12含量的测定(实训案例)
维生素B12含量的测定（实训案例）以维生素B12注射液中B12含量的测定为例介绍紫外分光光度法测定维生素B12含量的方法。
2.1.紫外分光光度法的测定原理维生素B12在紫外区278nm、361nm与550nm波长处有最大吸收。
在361nm 波长处的吸收峰干扰因素少，通常以361nm作为测定波长，测定待测溶液的吸光度，用吸光度计算含量。
2.2仪器与试剂752N型紫外－可见分光光度计，10mL容量瓶，5mL吸量管；0.1g/L维生素B12水溶液，维生素B12注射液(市售品)。
3．维生素B12注射液含量测定步骤准确吸取0.50mL维生素B12注射液于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，摇匀，得到样品稀释液。
然后将样品稀释液置于1cm石英比色皿中，以蒸馏水作为空白，在361nm波长条件下测定吸光度，按C63H88CoN14O14P的吸收系数为207计算维生素B12标示量的百分含量。
4.结果记录与计算4.1数据记录将所测数据填入下表。
6-2数据记录表4.2.结果计算注射液含量按下式计算。
样品中的维生素B12计算公式：式中 V---样品中维生素B12的含量，mg/mLB12A-----待测溶液的吸光度；-----比色皿的矫正值（吸光度）；AD-----供试样品的稀释倍数；注射液的标示量)，mg/mLW-----样品质量(VB12---吸收系数为207五、注意事项1. 测定过程需避光操作。
2. 在每次测定前，首先应做吸收池配套性试验。
即将同样厚度的4个比色皿都装相同溶液，在所选波长处测定各比色皿的透光率，其最大误差∆T应不大于0.5%。
3. 维生素B12在pH小于3或大于8的强酸或碱性溶液中极易分解，在pH值4.5～5.0弱酸条件下相对稳定，测定时可用乙酸-乙酸钠缓冲溶液调节。
4. 为使比色皿中测定溶液与原溶液的浓度一致，需用原溶液荡洗比色皿2~3次。
5. 比色皿内所盛溶液以超过皿高的2/3为宜。
过满溶液可能溢出，使仪器受损。
维生素B12注射液的定性鉴定及含量
代替。
实验原理
维生素B12是含有Co的有机化合物，为深红色 结晶或结晶性粉末。其注射液在278±1nm、 361±1nm、550±1nm波长处有最大吸收。
实验原理
通过对最大吸收峰处吸光度比值的计算，可对 其进行实性鉴定。中华人民共和国药典2000版 规定维生素B12的定性鉴定标准为：
E1% 1cm
361nm
A样 207
10
✓ 即为本试样稀释液1L中含维生素B12多少克。
✓ 将此值乘以稀释倍数，即得1L原注射液含维 生素B12多少克（g/L）。
实验步骤
1. 参看紫外—可见分光光度计仪器简介和
使用操作部分，熟悉其性能和操作方法。
接通电源，打开仪器，预热20min。
实验步骤
维生素B12注射液的定性鉴 定及含量的测定
实验目的
了解紫外—可见分光光度计的构造及正确 使用方法。
掌握吸收曲线的绘制方法。 掌握紫外—可见分光光度法对物质的定性
鉴定和含量测定。
实验原理
紫外分光光度法仍然是基于Lambert—Beer 定律
A = k·c·b
其中k为吸光系数。在条件改变时，吸光
E1% 1cm
361nm
E1Байду номын сангаас 1cm
278nm
A361 A278
1.70 ~ 1.88
E1% 1cm
361nm
E1% 1cm
550nm
A361 A550
3.15 ~
3.45
实验原理
维生素B12注射液含量测定是依据标准维生素
B12的
E1% 1cm
紫外可见分光光度法测定维生素B12含量
紫外可见分光光度法测定维生素B12含量作者:作者：靳月琴郭丽敏宋建荣杨金香刘海林陈文斌作者单位：长治医学院化学综合实验室(046000)【摘要】目的：探讨维生素B12片剂中维生素B12的含量测定方法。
方法：紫外可见分光光度法。
样品以标准曲线法为测定含量依据，在361 nm的波长处测定吸光度。
结果：维生素B12在5 μg/mL～100 μg/mL浓度范围线性关系良好。
回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结论：测定的5个不同批号样品其含量均在标示范围之内,该方法简便、准确、灵敏度高。
【关键词】紫外可见分光光度法；维生素B12片剂；含量测定The Content Measurement of V-B12 by UV-VisJin Yueqin,Guo Limin，Shong Jianrong,et al.Department of Chemistry Complex Laboratory of Changzhi Medical CollegeAbstract Objective：The measurement method of V-B12 content in tablet is established.Methods：UV-Vis The absorption is measured at 361 nm according to calibration carve method.Results：The linear range is in 5 μg/mL～100 μg/mL and the regression equation is Y=0.0193X+0.048,r=0.9937.Conclusion：The measurement is done in 5 kind of lot number and the result indicate that the V-B12 content in tablet corresponds with standard range. This method is simple, accurate and high sensitivity.Key words UV-Vis；V-B12 tablet；Content measurement维生素B12是含钴的有机药物，为深红色结晶，又称为红色维生素B12或氰钴胺，是唯一含有主要矿物质的维生素。
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紫外可见分光光度法测定维生素B12含量
作者:作者：靳月琴郭丽敏宋建荣杨金香刘海林陈文斌作者单位：长治医学院化学综合实验室(046000)
【摘要】目的：探讨维生素B12片剂中维生素B12的含量测定方法。
方法：紫外可见分光光度法。
样品以标准曲线法为测定含量依据，在361 nm的波长处测定吸光度。
结果：维生素B12在5 μg/mL～100 μg/mL浓度范围线性关系良好。
回归方程
Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结论：测定的5个不同批号样品其含量均在标示范围之内,该方法简便、准确、灵敏度高。
【关键词】紫外可见分光光度法；维生素B12片剂；含量测定
The Content Measurement of V-B12 by UV-Vis
Jin Yueqin,Guo Limin，Shong Jianrong,et al.
Department of Chemistry Complex Laboratory of Changzhi Medical College
Abstract Objective：The measurement method of V-B12 content in tablet is established.Methods：UV-Vis The absorption is measured at 361 nm according to calibration carve method.Results：The linear range is in 5 μg/mL～100 μg/mL and the regression equation is Y=0.0193X+0.048,r=0.9937.Conclusion：The measurement is done in 5 kind of lot number and the result indicate that the V-B12 content in tablet corresponds with standard range. This method is simple, accurate and high sensitivity.
Key words UV-Vis；V-B12 tablet；Content measurement
维生素B12是含钴的有机药物，为深红色结晶，又称为红色维生素B12或氰钴胺，是唯一含有主要矿物质的维生素。
测定维生素B12片剂含量的传统方法是运用紫外可见分光光度计，以吸光系数法为测定含量依据，但是该方法对仪器精密度要求较高。
标准曲线法是紫外可见分光光度法中最经典的方法，若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则该方法可消除因仪器而产生的一些误差，且操作简便易行［1］。
本文利用紫外可见分光光度计，建立了维生素B12片剂含量测定的标准曲线法，并利用该方法对山西亨瑞达制药有限公司生产的维生素B12片剂的5个不同批号进行了V-B12的含量测定，方法准确、简便、重复性好。
1 仪器与试药
1.1 仪器
754型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
1.2 试药
维生素B12对照品（中国药品生物制品检定所）；维生素B12片剂（山西亨瑞达制药有限公司，批号060801，060701，061002，060902，070303）。
0.8滤膜［AUTOMATIC SCIENCE （TIANJIN） INSTRUMENT CO；LTD］。
2 方法与结果
2.1 测定波长的选择
维生素B12吸收光谱上有三个吸收峰：278 nm、361 nm、550 nm。
维生素B12在361 nm的吸收峰干扰因素少，吸收又最强，中国药典规定以361 nm处吸收峰的比吸光系数E1%1 cm值（207）为计算含量依据［2］。
本实验选择361 nm为测定波长，以标准曲线法为计算含量依据。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备［3］：精密称定对照品维生素B12 0.0025 g，置于25 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
将溶解后的溶液放置冰箱中冷藏备用。
2.2.2 供试品溶液的制备：维生素B12片剂为糖衣片，取本品50片，除去糖衣，使其呈现粉红色，研细，精密称定研磨样品，约相当于维生素B12 1.25 mg(每片的标示量为25.0 μg),置50 mL容量瓶中，加水35 mL，充分振摇30 min使其溶解，加水稀释至刻度，密塞，再用力振摇10 min，静置，取上清液，用0.8 μm的微孔滤膜滤过，滤液放置冰箱中冷藏备用。
2.3 线性关系
标准曲线的绘制：精取2.2.1项下的储备液，用水分别按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀释，摇匀。
在361 nm波长处测定吸光度，结果见表1。
表1 100 μg/mL标准品稀释倍数测定结果（略）
以吸光度A与质量浓度c绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结果表明维生素B12对照品溶液在5.00 μg/mL～100.00 μg/mL范围内质量浓度与吸收程度呈良好的线性关系。
见图1。
2.4 精密度试验
精取浓度为100 μg/mL的对照品溶液在361 nm连续测定5次，测得维生素B12的平均吸光度为2.087，RSD为0.7%（n=5）。
RSD数值较小，说明该方法精密度好。
2.5 稳定性试验
取同一供试品溶液，在冰箱中冷藏2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按2.7项下含
量测定法测定，结果见表2，计算得平均吸光度为0.468，RSD为0.99%（n=5）。
结果表明供试品溶液在冷藏温度下24 h内基本稳定。
表2 供试品溶液冷藏温度下24 h内测定值（略）
2.6 重复性试验
精取同一批号样品，分别按2.2.2项的方法制备一式5份的供试品溶液，按2.7项下含量测定法测定，计算得维生素B12的平均含量为22.6 μg/mL（批号为070303），RSD 为 1.08%（n=5），说明该方法有较好的重复性。
2.7 含量测定
以水为空白，取2.2.2项下的滤液，摇匀，设定吸收波长为361 nm测定吸光度，按标准曲线法为计算含量依据。
结果见表3。
表3 维生素B12片剂含量测定结果（略）
维生素B12片剂的标示量为25.0 μg，由以上测定结果可知，山西亨瑞达制药有限公司生产的维生素B12片剂含量均在标示范围90.0%～110.0%之内。
RSD较小，说明该厂生产的药品含量稳定。
3 讨论
3.1. 维生素B12主要来源是动物性食物，存在于动物肝脏、牛肉、猪肉、蛋、牛奶和奶酪中。
在吸收时需与钙结合才能有利于人体的机能活动。
维生素B12能促进红血球的形成和再生，防止贫血；促进儿童发育，增进食欲；增强体力；维持神经系统的正常功能；促使注意力集中，增强记忆力与平衡感。
能使脂肪、碳水化合物、蛋白质适宜地为体内所利用。
维生素B12为细胞分裂和维持神经组织髓鞘完整所必须［４］。
主要用于治疗恶性贫血，与叶酸合用治疗因抗叶酸药、脂肪泻等引起的巨幼红细胞性贫血。
也用于多发性神经炎、肝炎、肝硬化、白细胞减少症等的辅助治疗，目前疗效有争议［５］。
口服维生素B12仅用于已证实维生素B12吸收正常的营养性维生素B12缺乏［６］。
3.2 本实验采取紫外可见分光光度法考察了片剂维生素B12的含量，将对照品按不同比例用水稀释，在361 nm波长处进行紫外可见吸收测定，得到标准曲线。
将维生素B12片剂研磨，精密称定并加水溶解，利用微孔滤膜过滤得到滤液，作为供试品溶液。
利用该方法得到的样品溶液，按中国药典规定波长361 nm测定吸光度，以标准曲线法为测定含量依据，结果表明，经紫外可见吸收测定，所测片剂含量均在标示范围之内。
3.3 本实验需避光操作。
维生素B12片剂为糖衣片，呈水溶性，除去糖衣时要刮净，研细，减小干扰，使溶解度增高。
3.4 因紫外可见分光光度法所需样品量少，本实验采用注射器过滤器进行过滤，得到供试品溶液。
3.5 本方法简便、准确、灵敏度高，可作为测定维生素B12片剂含量的方法。
【参考文献】
［１］李发美.分析化学［Ｍ］.第5版.北京：人民卫生出版社，2003，6：210.
［２］中国药典2005年版［Ｓ］.二部.北京：化学工业出版社，2005：668～669.
［３］李发美.分析化学实验指导［Ｍ］.北京：人民卫生出版社，2004：98～99.
［４］杨宝峰，苏定冯.药理学［］Ｍ.第6版.北京：人民卫生出版社，2003，7：303～304.
［５］徐叔云.中华临床药物学［Ｍ］.下册.人民卫生出版社，2003，5：1 141.
［６］陆晓和.实用临床用药监护［Ｍ］.北京：人民卫生出版社，2003，10：384.。