紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告.docx
蛋白质含量的测定
光路通过的“光面”。如比色皿外表面有液体， 应用滤纸吸干，以保证光路通过时不受影响。 (6) 若待测液浓度过大，应适当稀释，一般应使
吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜。
分光光度计
• 1．光源：钨灯或卤钨灯——可见光源 400～760nm 氢灯或氘灯——紫外光源 200～400nm • 2．单色器：把混合光波分解为单—波长光的装置 3．吸收池（比色皿） ： 玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英——不能吸收UV光，适用于紫外和可见光区 • 4．检测器：将光信号转变为电信号的装置 5．记录装置：讯号处理和显示系统
【实验步骤】
1、标准曲线法 （1）标准曲线的制作：取8只试管按表1-2加入试剂，摇匀。选择 光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280，以A280值为纵坐标， 蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表1-2 项目 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制 1 2 3 4 5 6 7 8
次放入%T校具（黑体），参比液，样品液1和样品液2。 （5）校具（黑体）校“0.000”：将%T校具（黑体）置入光路， 在T方式下按“%T”键，此时仪器自动校正后显示“0.000”
（6）参比液校“100”%T或“0.000”A：将参比液拉入光路中， 按“0A/100%T”键调0A/100%T，此时仪器显示“BLA”，表示仪器 正在自动校正，校正完毕后显示“100”%T或“0.000”A后,表示校 正完毕，可以进行样品测定。
（3）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。先用
自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋
洗，倒立于滤纸片上，待干后收回比色皿盒中。必
要时，比色皿用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。
(4) 比色皿内盛液应为其容量的2/3～3/4，过少会
试验三紫外分光光度法测定蛋白质
实验三 紫外分光光度法测定蛋白质一、原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强。
但是蛋白质恰恰相反，在280nm 的紫外吸收值大于260nm 的紫外吸收值。
利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。
但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。
在测定工作中，可利用在280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280nm —0.74A260nm ，式中：A280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得的光吸收值；A260nm 是蛋白质溶液在260nm 下测得的光吸收值。
Warburg 和Christian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对有核酸存在时所造成的误差作了评价，并作出了一个校正表(如下)。
紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子F0.6565.500.8461.1160.001.750.6320.6070.5850.5650.5450.5080.4780.4220.3770.3220.2786.006.507.007.508.009.0010.0012.0014.0017.0020.000.8220.8040.7840.7670.7530.7300.7050.6710.6440.6150.5951.0811.0541.0230.9940.9700.9440.8990.8520.8140.7760.7430.6820.250.500.781.001.251.502.002.503.003.504.005.001.631.521.401.361.301.251.161.091.030.9790.9390.874校正因子核酸%A 280nm /A 260nm校正因子核酸%A 280nm /A 260nm注：一般纯蛋白质的A280nm/A260nm 值为约1.8，而纯核酸的A280nm/A260nm 值为约0.5。
紫外分光光度法测定蛋白质含量_百度文库(精)
教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。
紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
紫外分光光度法测定蛋白质的含量
１ ． ３ 方 法
１ ． ３ ． １ 吸收 曲线 的绘 制
１ ． ３ ． ３ 待 测 样 品 的 测 定
取２ ｍＬ的待测蛋 白质溶液 ，用 ０ ． ９ ％的 Ｎａ Ｃ １ 溶液稀 释至
１ ０ ｍＬ ， 按上述 方法测定 ２ ７ ９ ｎ ｌ ｎ处的吸光度值 。 平行测定三次 。 结果 见表 ３ 。
＝
０ ． ６ ０ ０ ｍｇ ／ ｍＬ；样 品标准偏差 ｓ ＝ ［ ∑ （ ｘ 一 ｘ ） ／ （ ｎ 一 １ ） ＝ ０ ． ０ ７ ８ ；相对
标准偏差 Ｓ ｒ ＝ Ｓ ／ ｘ ＝ Ｏ ． ０ ２ ６ 。
２ ． ２ 结 果分 析
２ ＿ ２ ． １ 影 响 本 测 定 方 法 的 因 素
ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ． Ｔｈ ｉ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｂ ｙ ＵＶ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ． Ａｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｉ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ． Ｗｅ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ａ ｎ ｄ ｓ ｕ ｍｍａ ｒ ｉ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｉ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ． Ｉ ｔ ｗａ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ， ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ ｒ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ． Ｅｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ａ ｌ ｌ ｙ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｏｒ ｆ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｍ ｉ ｒ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｏ ｗ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ＵＶ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ；ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ；ｄ ｅ ｔ ｅ ｍ ｉ ｒ ｎ ｉ ｎ ｇ
紫外分光光度法测定蛋白质含量
实验预习
预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。 预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。 了解TU-1901紫外 可见分光光度计的主要构造。 了解TU-1901紫外-可见分光光度计的主要构造。 紫外-
紫外分光光度法测定蛋白质含量
学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
实验目的
掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 掌握TU-1901紫外 掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了 紫外解此仪器的主要构造。 解此仪器的主要构造。
实验步骤
1. 标准曲线的制作 ： 用吸量管分别吸取1.0 1.5、 用吸量管分别吸取1.0 、1.5、 2.0 、2.5 、3.0 mL 5.00 mg.mL-1 标准蛋白质溶液于5 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻 比色管中， NaCl溶液稀释至刻 度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 cm石英比色皿 石英比色皿， 0.9%NaCl溶液为参比 溶液为参比， 摇匀。 nm处分别测定各标准溶液的吸光度 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A280，记录所得读数。 处分别测定各标准溶液的吸光度A 记录所得读数。 2. 样品测定： 样品测定： 取待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定280 nm处的吸光度 取待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定280 nm处的吸光度。 处的吸光度。 平行测定三份。 平行测定三份。
仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管 TU-1901紫外 可见分光光度计，比色管， 紫外标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液 标准蛋白质溶液： 0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液 NaCl溶液 溶液，
紫外分光光度法测蛋白质的含量
紫外分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。
3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
该测定方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。
1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。
定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。
2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。
该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
国标紫外分光光度法测定蛋白质含量
国标紫外分光光度法测定蛋白质含量蛋白质是构成生物体内各种细胞、器官和组织的主要物质之一，其含量的测定对于科学研究和工业生产具有重要意义。
目前国际上常用的测定蛋白质含量的方法有比色法、低力荧光素法和生物素-四硫化物法等，而国家标准推荐使用紫外分光光度法测定蛋白质含量，因其准确性和可靠性较高，具有广泛适用性。
一、实验原理国标紫外分光光度法利用蛋白质分子内含有色氨酸（W）、酪氨酸（T）和苯丙氨酸（F）等氨基酸团的紫外吸收特性，即在近220nm处有吸收峰。
通过分析样品在220nm处的吸光度值，就可以计算出其蛋白质含量。
二、实验步骤1. 样品的制备将所需测定的物质按照预定比例溶解在适量的缓冲溶液中，混合均匀，离心沉淀物质后，称取上清液并记录其质量，得到样品洗脱液。
2. 样品的测定(1)制备含有对照蛋白质的样品洗脱液。
将已知浓度的蛋白质按需求浓度稀释后，制成一系列的对照样品，称取适量的对照样品，经过与样品液的处理过程相同的操作后，得到对照样品洗脱液。
(2)利用紫外分光光度计测量样品洗脱液和对照样品洗脱液在220nm处的吸光度，记录数据。
(3)计算样品洗脱液中蛋白质的含量。
根据统计学方法，将同一浓度蛋白质的对照样品的吸光度取平均值，并绘制标准曲线。
根据样品洗脱液的吸光度值和标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。
三、实验注意事项1. 操作时需严格按照实验指导书的规定操作。
2. 紫外分光光度计在对样品洗脱液进行吸光度测定时，应使用二元芳香胺半波长试管作为样品池。
3. 为防止各种最终洗涤液误差的影响，应利用含有NaHCO3 or Na2CO3的去离子水作为纯化洗涤液。
四、实验结果的分析利用国标紫外分光光度法测定出的蛋白质含量，可点评该样品是否符合质量要求。
若蛋白质含量低于标准要求，则说明样品质量不好，需再次提取纯化；若蛋白质含量超过标准，则说明提取效率较好，但仍需注意实验中的误差，以获得更加准确的结果。
总之，国标紫外分光光度法测定蛋白质含量是一种可靠、简便、经济的方法，可广泛应用于生物科学、医药研究、食品工业等领域，对于推动相关研究和产业发展起到了积极的促进作用。
紫外分光光度计——蛋白质含量测定
紫外分光光度计——蛋白质含量测定紫外可见分光光度法是在190～760nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
紫外分光光度法测量光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁辐射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。
光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。
分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。
在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。
在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。
蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和利研的众多领域。
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紫外分光光度法测定蛋白质含量
一、实验目的
1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；
2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。
二、实验原理
1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。
本实验采用紫外分光光度法。
2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。
利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
三、仪器与试剂
TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。
10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。
四、实验步骤
1.绘制吸收曲线
用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。
2.绘制标准曲线
用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。
3.样品测定
取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。
在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次五、数据处理与结果分析
图1吸收曲线
在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长225nm处的吸收峰远大于280nm处，这是由于在波长250nm以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大，所以，蛋白的最大吸收波长应为280nm。
图2标准曲线
将试样所测得吸光度带入标准曲线中求蛋白质含量：
稀释以后的蛋白质的浓度 c x =(Abs -0.0202)/0.6407
原试样中蛋白质浓度 c=(c x *10)/2
单次测定的标准偏差:
s =
1
)(1
2
--∑=-
n c c
n
i
i
=2075.0060.0135.0222++
=0.12
相对标准偏差： s r =-c
s
×100% =%100126
.212.0⨯=5.5%。