细胞培养实验和Western Blot实验报告
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
Western-Blotting实验报告
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
免疫印迹实验报告——westerblot
免疫印迹实验报告——westerblotWestern blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
Western blotting实验报告
Western BlottingLin Chengyu Bio 04 2010030007 Cooperator: Liu Yidi1Introduction1.1Background informationWestern blotting is the procedure that proteins separated by PAGE may be transferredfrom the gel to a thin support matrix, usually a nitrocellulose membrane, which stronglybinds and immobilizes proteins. The protein blots on the membrane surface are thenutilized for further analysis, often coupled with immunological detection techniques.This experiment takes human and horse IgG as the antigen. After treated by SDS-PAGE,transfer the proteins to the nitrocellulose membrane and take rabbit-anti-horse IgG as theprimary antibody, and enzyme-linked goat-anti-rabbit IgG as the secondary antibody.1.2Major principlesWestern blotting consists of two major steps, immobilization and immunoblotting.Immobilization mainly uses electric field force or gravity, as shown in Figure 1.Figure 1 ImmobilizationThe proteins, carrying negative charges, move against the electric field to the anode, thatis, from the gel to the nitrocellulose membrane.Immunoblotting uses immunological techniques, as shown in Figure 2.Figure 2 Immunoblotting1Blocking step is necessary which will block all the remaining hydrophobic binding siteson the nitrocellulose membrane. The primary antibody recognizes the specific proteinand is recognized by the enzyme-linked secondary antibody, so both of them bind totheir target. The enzyme linked to the secondary antibody catalysis the specific reactionwhich leads to light or color, which can be recognized as a band on the nitrocellulosemembrane.2Experiment operation2.1SDS-PAGE(1)Prepare an 8% SDS-PAGE gel;(2)Load the samples in the gel following Table 1;Table 1 The loading plan of SDS-PAGE(3)Galvanize the gel box to separate proteins;(4)Take the gel from gel box, then cut it into 2 separate gels between Lane 6 and 7;(5)Stain one gel with (Lane 1-6) with Comassiee Brilliant Blue overnight. Distain itlater to make the original copy to compare with the other gel which is for transfer.2.2Immobilization(1)Prepare 8 pieces of filter paper and one nitrocellulose membrane in the same size asthe gel and soak them in transfer buffer for 15 min;(2)Soak the SDS-PAGE gel in the transfer buffer;(3)Place the gel, filter papers, and nitrocellulose membrane following the order shownin Figure 1;(4)Transfer in constant-current electrophoresis (I = A / cm2 * 0.8 mA) for 1.5 h;(5)Soak the membrane in BSA solution for blocking non-specific protein-binding, 4 ºCovernight.2.3Immunoblotting(1)Wash the membrane with fresh PBST and keep in this environment;(2)Cover the membrane with primary antibody solution in a plastic bag and seal it;(3)Incubate for 2 h at R.T.;(4)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(5)Cover the membrane with secondary antibody solution in a plastic bag and seal it;(6)Incubate for 1.5 h at R.T.;(7)Wash the membrane with fresh PBST, 5 min for each time, and repeat twice;(8)Develop the membrane in substrate solution;(9)Stop the developing step in ddH2O and dry the membrane in filter paper directly. 3Raw data and its processing3.1SDS-PAGEThe gel image is shown in Figure 3.Figure 3 SDS-PAGELane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGHuman IgG band is at approx. 100 kDa, while horse IgG smaller, at approx. 95 kDa.3.2ImmunoblottingThe membrane image is shown in Figure 4.Figure 4 ImmunoblottingLane I: 10 μL human IgGLane II: 10 μL horse IgGLane III: 5 μL human IgGAs can see in Figure 4, using rabbit-anti-horse IgG anti-serum as the primary antibody,Lane II, which contains 10 μL horse IgG, shows a clear and dark band. And there iscross binding between rabbit-anti-horse IgG anti-serum and human IgG, which isindicated by two bands shown in Lane I and Lane III. What’s more, the higher theconcentration (10 μL vs. 5 μL), the more cross binding are shown in the membrane.4Result and discussion4.1Result4.1.1The human IgG is about 100 kDa, and horse IgG 95 kDa.4.1.2The specific binding between horse IgG and rabbit-anti-horse IgG anti-serum isgood, while there is cross binding between human IgG and rabbit-anti-horseIgG anti-serum.4.2Discussion4.2.1Lane I in SDS-PAGEThe band in Lane I which corresponds with 10 μL human IgG is not parallel tothe slots. The most probable reasons are:(1)While loading, the samples stays too long time in the slot;(2)The surface of the concentrated gel is not flat in Lane I;(3)The surface of the separating gel is not flat due to unsuitable removal of thecomb.4.2.2Horse IgG band in immunoblottingThe band is not sharp enough, because there are lots of subtypes of horse IgG,causing a bad separate effect.4.2.3Lane II in immunoblottingAs can see in Figure 4, Lane II contains lots of regions that is also colored(background), it is mainly because during the washing step, especially washingthe primary antibody, we add too much PBST in the petri dish, causing littlewashing force, and lots of primary antibody remaining on the membranenon-specific binding to the proteins.5Reference【1】/biotech/exp/protein/westernblot/2009/e89175533.html。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
免疫印迹 实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。
实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。
2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。
4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。
5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。
6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。
7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。
8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。
9. 使用图像分析软件分析结果。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。
在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。
首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。
通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。
接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。
通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。
在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。
通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。
在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。
一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。
在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。
接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。
二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。
最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。
ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。
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细胞培养实验和Western Blot实验报告
姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学
实验一：细胞培养
1.实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。
2.实验原理
从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
3.实验用品
3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。
2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
4.实验方法
4.1 原代细胞培养
4.1.1 原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
4.1.2 操作
①．取材
用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
②．切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
③．消化、接种培养
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
4.1.3 结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
4.2 传代细胞培养
4.2.1 原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞培增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
4.2.2 操作
①．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。
(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。
②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即
在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。
③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml
左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
4.2.3 结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项
4.3.1 器材和液体的准备
细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。
4.3.2 无菌操作中的注意事项
在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。
操作前20～30分钟起动超净台吹风。
操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。
培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。
操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。
使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。
总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
实验二：Western Blot实验
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。
定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3 、电泳分离蛋白质
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。
常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
各种膜的技术参数及比较如下：
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。
常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。
由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。
如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。
孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！
7 、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。
如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。
孵育条件一般为室温1-2小时
8 、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。
一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9 、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。