基因引物设计PPT课件
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
PCR引物的设计公开课获奖课件
引物 引物旳主要性 引物设计旳原则 引物与PCR 引物设计软件 怎样使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
引物（primers)
引物是人工合成旳两段 寡核苷酸序列，一种引 物与感爱好区域一端旳 一条DNA模板链互补， 另一种引物与感爱好区 域另一端旳另一条DNA 模板链互补。
改为vspace=PU便能够使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
怎样使用Primer Premier 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
探针设计 引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
– 尽量选择与非目旳基因同源性小旳序列作为 引物
– 选择3’端与非目旳基因不同源旳序列作为引 物
– 选择两个引物3’端与同一非目旳基因不同源 旳序列作为引物
– 假如3’端为富含G、C旳构造，只需3’端几种碱基 与模板互补结合，就可能引起延伸，造成假引起。
引物旳保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽量多旳型别
特异性：防止非特异性扩增
扩增区域旳二级构造
模板DNA旳某些区域具有高度复杂旳二级构造， 在选择引物时，应使扩增区域尽量避开这些区 域。 – 扩增区域旳自由能（△G。）不大于 58.61kJ/mol
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物旳主要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分主要旳 地位。PCR旳特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目旳DNA结合， PCR旳敏捷性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效旳延伸，可见引物设计好坏与 PCR成果亲密有关。
《引物设计教程》课件
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
基因引物设计方法
基因引物设计方法Genomic primers are short, single-stranded nucleic acid sequences used in polymerase chain reactions (PCR) to amplify target DNA sequences. They are essential in molecular biology research, facilitating the specific amplification of DNA regions of interest. The design of effective primers is crucial for the success of PCR experiments, as they determine the specificity and efficiency of DNA amplification.基因引物是在聚合酶链反应（PCR）中使用的短的单链核酸序列，用于扩增目标DNA序列。
它们在分子生物学研究中至关重要，有助于特异性地扩增感兴趣的DNA区域。
有效引物的设计对于PCR实验的成功至关重要，因为它们决定了DNA扩增的特异性和效率。
When designing genomic primers, several factors must be taken into consideration. The first is the specificity of the primers, ensuring that they only amplify the target DNA sequence and not other regions of the genome. This requires careful selection of the primer sequences to match the target sequence with high precision.设计基因引物时，必须考虑几个因素。
DNA的PCR引物设计
引物筛选（一）
• UCSC PCR （1）是否有产物，产物大小 （2）所扩出的产物是否包含整个外显 子 （3）离外显子第一个碱基及最后一个 碱基的距离 （4）温度是否在合适范围内
前导链
后随链
chrX:32716928-32717613 686bp
Forward: 61.7 C tactgctcatctcattggtctgc Reverse: 60.4 C agtttgcctttcatttcattgtg
DNA的PCR引物设计
黄燕茹 2012.07.19
引物设计的原理
• 长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为20-25bp.
• Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60℃，尽可能 保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。 若引物中的G+C含量偏低，则可以使引物长度稍 长，而保证一定的退火温度。
• （G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般 为40～60％。
引物筛选（二）
• UCSC Blat
• •
正反链各一条 特殊情况下，其中正链或反链有两条也可 最好是正反链各只有一条
Байду номын сангаас
引物筛选（三）
• NCBI BLAST
引物筛选（三）
BLAST
Nucleotide blast
有义链NNNNNNNNNNNNN无义链
选择“somewhat similar…..” ,然后“BLAST”
• 碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布 最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶， 尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C
• 引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以 上的互补序列，如回文结构，发夹结构等， 否则会影响到引物与模板之间的复性结合， 尤其避免3’末端的互补。
基因工程入门-引物设计
引物设计1,序列gene 252709..253161/gene="yafP"/locus_tag="b0234"/note="synonyms: ECK0235, JW0224"/db_xref="ECOCYC:G6118"/db_xref="EcoGene:EG13153"/db_xref="GeneID:944912"CDS 252709..253161/gene="yafP"/locus_tag="b0234"/codon_start=1/transl_table=11/product="predicted acyltransferase with acyl-CoA N-acyltransferase domain"/protein_id="NP_414769.1"/db_xref="GI:16128220"/db_xref="ASAP:ABE-0000801"/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:Q47158"/db_xref="ECOCYC:G6118"/db_xref="EcoGene:EG13153"/db_xref="GeneID:944912"在DNA序列文件中找到相应的序列252709..253161 252661 attgggaaaa tggcagaagc gtttcgcatg cgtttttgaa tttatattat gaataacata252721 caaataagaa actatcagcc tggcgatttt cagcaactat gcgctatttt cattagagcg252781 gttacgatga ccgccagtca gcattattca ccacaacaaa tttccgcctg ggcgcagatt252841 gacgaatctc gctggaagga gaaactcgcg aaatcacaag tgtgggttgc gatcattaat252901 gcacaaccgg ttggttttat ttcccgcatt gaacattata tcgatatgtt atttgttgac252961 cctgaataca cccgccgtgg ggttgccagc gctttgttaa aacctttgat taagtctgaa253021 tccgaactta cggtggacgc aagcataacc gcaaaaccct tttttgaacg ttatggtttt253081 cagacagtta agcagcagcg cgttgaatgc cggggagcgt ggtttactaa tttttatatg253141 cgatataaac cgcaacatta aatccagctt gcaatgaaaa taacgcccgc ctggtatgtgORF去除空格、回车键，数字后和多余碱基的序列atgaataacatacaaataagaaactatcagcctggcgattttcagcaactatgcgctattttcattagagcg gttacgatgaccgccagtcagcattattcaccacaacaaatttccgcctgggcgcagattgacgaatctcgctggaaggagaaactcgcgaaatcacaagtgtgggttgcgatcattaatgcacaaccggttggttttatt tcccgcattgaacattatatcgatatgttatttgttgaccctgaatacacccgccgtggggttgccagcgctt tgttaaaacctttgattaagtctgaatccgaacttacggtggacgcaagcataaccgcaaaacccttttttga acgttatggttttcagacagttaagcagcagcgcgttgaatgccggggagcgtggtttactaatttttatatg cgatataaaccgcaacattaa搜索Bam HI和Hin dIII 位点结果如下发现基因中不存在Bam HI和Hin dIII 位点，故正反向引物的5’端分别引入Bam HI 和Hin dIII序列ORF的检查：利用DNASIS软件的Translate功能将核苷酸Internet Explorer.lnk信息翻译成为氨基酸序列，ATG为起始密码子。
primer5.0已知基因序列,设计引物
Primer5.0 目的基因序列引物设计
GA TTtCTTGGCTTtATA TA TCTTGT GGAaAGGaCGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCAC ATATACTAGTCGACGGGTCTAGACAA TGA TGCTGGGTAA TGACACCAAGCTGGGACTG GTACAGAAAGTCAGAGAACACTTACAGAACGGCA TCTAGACAATGA TGCTGGGTAATA CACTTACAGAACGGCA TCTAGA TGCCGTTCTGTAAGTGTTTGTTGAATGAATGAGTGTT GAACAAACTGCTAAGGTATCTTT ACAAGGTAG
从中扩增出目的基因片段（绿色的部分）：
首先：将绿色部分复制到primer5.0引物设计软件中，ctrl+v用鼠标右键不管用
.选择As is后，惦记OK出现：
然后惦记，出现
图中右上角标记，其中惦记S合成的是上游引物，A是下游引物，点击S后出现，然后点击出现
这些就是上游引物，选中后ctrl+c复制到引物合成单中，发给公司，下游引物：回到
点击A出现
用前后调节框，如下，将序列向右移动移到最后，得到下图
注意显示的是3—5，ctrl+c—ctrl+v后悔发现序列变成5---3了，这是软件的好处，因为公司引物合成就是从5—3的
其实上下游引物只是相对的，将得到的引物序列填表后发给公司就好了。
引物设计
无任何特异性
03
目的基因的获取-PCR引物设计
特异引物设计：
通用引物设计：
1、扩增的完整序列完全已知 1、扩增保守的同源基因
2、扩增序列长度要≥CDS
2、扩增序列长度一般<CDS
3、引物长度18-22，得分高
3、一般测序用
4、要blast
4、不用个人设计
5、测序时要提供引物，连到T载 5、测序不需要提供引物
03
PART THREE
引物设计原则和方法
03
目的基因的克隆
基因工程的主要目的是把经过遗传学和分子生物学前期 研究探明了结构与功能的靶基因（target gene）转导 宿主细胞中表达，以大量获取该基因的产物或改变宿主 性状。由此可见，如何分离得到靶基因是基因工程操作 的关键步骤之一，否则“巧妇难为无米之炊”。
序不好进行
3、 随机6或9个mers
4、要获得完整基因要做步移
PCR或反向PCR或测完整基因组
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计软件： 1、Oligo 6 2、Primer premier 5/6 3、Dnastar 4、Primer 3plus（在线）
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物二聚体
发夹结构
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计种类：
引物
克隆引物 表达引物
特异引物Specific
primers
只扩增某一类基因或生物
通用引物Universal 与基因两端基因匹配（载体）
Primers
兼并引物Degenerate 可以扩增某一类相似基因
Primers
随机引物
Random primers
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引物设计
兼并引物 RACE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物
12
总原则
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特 异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
蛋白结构域分析：SMART( http://smart.emblheidelberg.de/ )；
蛋白理化性质分析及二、三级结构分析： EXPASY( http://www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( /psipred/ )；
B=G/C/T N=A/G/C/T 简并度：
14
兼并引物设计步骤
利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或 cDNA编码的氨基酸序列
对所找到的序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计兼并引物（软件或者人工）
15
选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还
6
3’RACE:
原理：
7
5’RACE
原理：
8
注意事项：
RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5’RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录；
9
序列分析
引物设计：Primer 5.0；
一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；
是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR;
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RACE引物
各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做
5’RACE； 尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端； 5’RACE-
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
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兼并碱基：
兼并引物
M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T
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染色体步移克隆启动子
22
Tail-PCR
23
荧光素酶活性检测 试剂盒
24
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
信号肽分析： SignalP( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )；
磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )；
糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；
25
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html )；
序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http://emboss.bioinformatics.nl/ )；
构建进化树:MEGA 4.1；
10
的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计 划； 了解相近物种该基因的信息，以利于扩增 过程中预测PCR的延伸时间；
4
同源片段的克隆
本实验室的EST数据库； NCBI数据库； RT-PCR用兼并引物扩增同源片段； ✓ 设计兼并引物是重点！！！！！
5
注意事项：
高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析；
常用实验技术简介
2011-8-4
1
目录
全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术
2
全长cDNA克隆
是许多后续更深入实验的基础；
真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；
全长cDNA克隆方法：灵活掌握； ➢ 同源克隆技术 ➢ RACE-PCR技术
3
基因克隆前的准备工作
看有没有被别人克隆出来； 查看文献了解基因的功能及表达特征； 了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性
5’末端）；
17
荧光定பைடு நூலகம்引物
纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3’末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析；
18
染色体步移引物
以DNA为模板设计引物； 3条重叠引物； 高的退火温度：高于60度；
19
原核表达用引物
会读表达载体图谱；
去除信号肽序列；
根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注 意要不要加终止密码子；
在引物的5’末端加酶切位点和相应的保护碱基， 注意方向；
选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶
是否可以在统一体系中进行双酶切；
20
PCR-SSCP引物
PCR产物长度：150-400bp； 高的特异性；
序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2；
序列在线比对：NCBI-BLAST ( / )；
序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (/Tools/msa/clustalw2/)；