HRM甲基化位点检测的灵敏性
DNA甲基化检测技术
谢谢！
MGMT P15
增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变
p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 细胞的过度激活与增殖
乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌
肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌
DNA甲基化检测之 甲基化特异性HRM检测技术
（ Methylation-sensitive high resolution melting）
内容提示
DNA甲基化的定义及生物学意义 MS-HRM检测的原理 MS-HRM检测的方法及步骤 MS-HRM检测结果分析
DNA甲基化的定义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添 加甲基基团的化学修饰现象。
DNA甲基化与肿瘤的关系
肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 ——被激活； 抑癌基因高甲基化 ——被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化
水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力 就越高，临床分期也愈晚
常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用
基因
APC
BRCA1 CDKN2A/p16 DAPK1
基因沉默对肿瘤的意义
肿瘤类型
对细胞增殖、迁移、粘附、骨重组及染色质稳定性 乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝
失去调节作用
癌
与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂
乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌
钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌
E-cadherin ER GSTP1 hMLH1
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
甲基化的检测方法
甲基化的检测方法
甲基化是DNA分子上的一种化学修饰，可以影响基因的表达和细胞功能。
目前常用的甲基化检测方法主要包括以下几种：
1. 甲基化特异性PCR（MSP）：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA的不同性质，设计特异性引物进行PCR扩增，从而区分甲基化和未甲基化DNA序列。
2. 甲基化特异性限制性内切酶消化（MSRE）：该方法利用某些限制性内切酶能够识别和切割甲基化的DNA序列，未甲基化的DNA序列则不会被切割。
通过PCR扩增和酶切消化后的DNA片段的比较，可以确定DNA的甲基化状态。
3. 甲基化敏感性扩增片段长度多态性（MS-AFLP）：该方法结合了甲基化敏感性消化和扩增片段长度多态性技术，通过比较不同条件下DNA的电泳图谱，可以检测DNA上的甲基化差异。
4. 甲基化敏感性DNA芯片：基于微阵列技术，利用甲基化敏感的酶或甲基结合蛋白与样品中的甲基化DNA发生特异性结合，然后利用荧光标记的方法检测结合程度，从而实现快速和高通量的甲基化检测。
5. 甲基化测序：基于高通量测序技术，通过甲基化特异性捕获、测序和数据分析，可以获得全基因组的甲基化谱图，从而全面了解基因组中的甲基化变化。
这些方法各有优缺点，选择合适的方法取决于研究目的、样本特点和实验条件等因素。
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
二代测序检测甲基化的方法
二代测序检测甲基化的方法二代测序是一种高通量测序技术，可以快速、准确地获得大量的DNA或RNA序列信息。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，对于基因表达、细胞分化、发育和疾病等方面起着重要的调控作用。
因此，准确检测甲基化状态对于深入研究基因组学和表观遗传学具有重要意义。
本文将介绍二代测序检测甲基化的方法及其应用。
常用的二代测序检测甲基化的方法主要有甲基化敏感限制性内切酶测序（MRRBS）、甲基化敏感PCR测序（MSP、Methyl-Seq）和甲基化特异性抗体免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）等。
甲基化敏感限制性内切酶测序是一种经典的二代测序方法，其原理是利用甲基化敏感的限制性内切酶将未甲基化的DNA片段切割成短序列，再进行测序。
通过比较未甲基化和甲基化的DNA片段，可以推测出DNA的甲基化状态。
该方法具有高准确性和较低的成本，被广泛应用于甲基化研究领域。
甲基化敏感PCR测序是一种基于PCR扩增的方法，主要用于检测少量样品或特定位点的甲基化状态。
该方法通常包括甲基化特异性PCR和测序两个步骤。
首先，通过甲基化特异性PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA片段，并在PCR过程中引入特定的标记。
然后，将扩增产物进行测序，通过分析序列数据来确定甲基化状态。
该方法具有高灵敏度和高特异性，适用于甲基化位点的快速检测。
甲基化特异性抗体免疫沉淀测序是一种利用甲基化特异性抗体与甲基化DNA结合的方法。
首先，将甲基化的DNA片段与甲基化特异性抗体进行免疫沉淀，然后通过测序来获得甲基化DNA的序列信息。
该方法可以直接检测全基因组的甲基化状态，具有高通量和高分辨率的特点。
然而，由于抗体的特异性和亲和力等因素的限制，该方法可能存在一定的假阳性和假阴性结果。
除了上述方法，还有一些新兴的二代测序方法被用于甲基化检测，如全基因组甲基化测序（WGBS）、甲基化基因组测序（MethylC-Seq）和环状化学修饰测序（EM-Seq）等。
这些方法在测序技术和生物化学方法上有所改进，能够更加准确地检测甲基化状态。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。
大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。
下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。
在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。
在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。
若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。
不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。
另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。
扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。
若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。
高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
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HRM甲基化位点检测的灵敏性
点击次数：142 发布日期：2010-10-12 来源：本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负
利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性
引言
DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。
CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。
传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。
甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。
本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。
如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。
未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。
通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。
引物设计在扩增片段大小在
79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。
100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。
当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。
高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。
重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。
瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。
本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG岛上游甲基化位点用Vidaza或Cladribine处理，重亚硫酸盐处理的CpG甲基化变化的最高的进行PCR扩增，之后用LightScanner进行高分辨溶解曲线分析。
样品经亚硫酸盐处理后有不同的的胞嘧啶的转换，然后通过单独和混合后分析检测的灵敏性。
不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。
这一结果证实了高分辨熔解曲线是检测甲基化位点的简单且灵敏度高的方法。
图1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。
甲基化的和非甲基化的样品都使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后进行PCR扩增，Lightscanner检测，最后通过测序验证。
图1A：重亚硫酸盐处理的100%甲基化的和100%非甲基化的四个片段。
图1B：79-216bp的有2-8个CpG位点的甲基化的和非甲基化的片段进行不同比例的混合。
对CpG较少的小片段的检测的灵敏度在2%，有较多CpGs的大片段的检测的灵敏度在10%。
图1C：包含一个CpG位点的110bp，甲基化和非甲基化的样品按不同比例混合。
（8个重复）
图2：甲基化抑制剂处理患者CpG岛
下图为用甲基抑制剂Vidaza或Cladribine处理前后microRNA195（269bp）的上游CpG岛甲基化位点的变化
图3：miR-195 CpG岛的269bp扩增区
两个不同的病人的CpG位点见下表
图4：miR-195 CpG岛的150bp扩增区
图5：从4个CLL患者中克隆miR-195可能调控区，使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后PCR扩增，Lightscanner检测，测序。
不同的患者采取不同的甲基化模式扩增（0-8 Cs）。
熔解曲线是含有18 CpG位点的269bp的片段（A）和含有5 CpG位点的150bp的片段（B）。
图6：等量混合不同患者的进行不同甲基化模式的克隆，并扩增了含有5CpG的150bp的片段。
使用甲基抑制剂处理前后进行甲基化和未甲基化控制的比较，熔解曲线分别为患者P3（A），P4（B），V1（C），V3（D）。
图7：甲基化的和非甲基化的DNA样品按不同的比例混合，150bp的片段含有5和CpG位点。
用不同的DNA甲基化模式来评价LightScanner 高分辨熔解曲线的能力。
用质粒控制含100%甲基化的和未甲基化的部分表现出一定的剂量关系，50%混合后与未甲基化的偏离程度最大。
分析结果证明对小片段的甲基化检测的灵敏度在2%，大片段的灵敏度在10%。
在CLL分析中，经过甲基抑制剂处理后检测患者miR-195基因CpG岛的甲基化位点。
不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。
结论证实了使用高分辨溶解曲线是检测甲基化位点简单且灵敏的方法。