ELISA的基本原理
ELISA的基本原理
ELISA的基本原理[1]ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。
因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部份包括：（1）包被的抗原或者抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或者试管；（2）酶标记的抗体或者抗原和（3）酶的反应底物等。
抗原或者抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或者抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。
整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或者产生荧光或者发光反应为标准，显色或者产生荧光或者发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或者反比关系。
目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。
二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3]通常所提到的抗原与抗体的相互作用，普通指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。
（一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或者抗原受体所占体积比的增加而增加。
当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。
这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或者抗原包被的界面接触的较小的区域内。
也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或者使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或者使用微颗粒来做到这一点。
微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或者珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。
所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或者抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。
（二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或者抗原有接触的部份，这部份体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。
该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。
2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。
该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。
3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。
酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。
4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。
操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。
将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。
2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。
3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。
4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。
5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。
6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。
7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。
8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。
9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。
10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。
简述ELISA的原理及应用
简述ELISA的原理及应用1. ELISA的基本原理ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附试验）是一种基于抗原-抗体相互作用的免疫分析方法。
其基本原理如下：1.试样处理：将待测样品加入含有抗原的微孔板中，并进行适当的处理，例如稀释、加入试剂等。
2.抗原结合：抗原与待测样品中的特定抗体发生特异性结合。
3.酶标记：将与抗体结合的酶（常用的有辣根过氧化物酶-HRP）加入，使其与抗原-抗体复合物结合。
4.底物反应：加入与酶结合产生颜色反应的底物，使酶催化底物发生显色反应。
5.检测与测量：使用酶标仪测量底物的颜色反应强度，通过光密度的变化来判断待测样品中抗原的含量。
2. ELISA的应用领域ELISA作为一种高灵敏度、高特异性、简单易行、经济实用的免疫学检测技术，具有广泛的应用领域，包括：2.1 医学诊断ELISA可以用于检测各种疾病相关的标志物，例如病毒、细菌或癌细胞表面抗原、抗体、药物等，用于疾病的早期诊断、病情监测和治疗效果评估。
例如，用于HIV、乙肝、丙肝、白血病、甲亢、风湿性关节炎等疾病的诊断。
2.2 食品安全ELISA可以检测食品中的有害物质、致病菌、残留农药等，用于食品质量安全的监测和评估。
例如，检测食品中的重金属、农药残留、抗生素残留等。
2.3 环境监测ELISA可以用于检测环境中的有害物质、污染物、微生物等，用于环境质量的监测和评估。
例如，检测水中的重金属、有机污染物、细菌、病毒等。
2.4 兽医诊断ELISA可以用于动物疾病的诊断，包括畜禽的传染病、寄生虫感染等。
例如，检测畜禽血清中的病毒抗体、寄生虫抗原等。
2.5 生物学研究ELISA可以用于研究生物分子的相互作用、测定分子浓度、分析分子结构等。
例如，测定蛋白质、核酸、多肽等的含量、活性和相互作用。
3. ELISA的优势和局限性ELISA作为一种常用的免疫分析方法，具有一些明显的优势，也存在一些局限性。
ELISA的基本原理
ELISA的基本原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。
它基于特定抗原与特异性抗体之间的结合来检测和定量分析物质的存在和浓度。
ELISA的基本原理包括涂层、结合、洗涤、检测和数据分析等步骤。
首先，在一个固定的载体表面（通常是酶标板）上涂覆特定抗原或抗体。
这个过程被称为固定抗原或抗体的"涂层"。
涂层的目的是将目标物质捕获在表面上，使其能够与特异性抗体发生结合。
接下来，将待测样品加入涂层好的酶标板孔中。
如果样品中存在目标物质，它们将与被固定在酶标板上的特异性抗体结合。
这个过程被称为结合。
随后，进行洗涤步骤以去除非结合的物质。
这个步骤使得只有与抗原或抗体结合的物质保留在酶标板上，减少假阳性的可能性。
然后，加入与被检测物质特异性结合的标记抗体。
这些标记抗体通常与一种酶相关联。
当标记抗体与特定的目标抗体结合时，酶的活性被引入和固定在酶标板上。
最后，通过加入相应的底物，酶的活性可通过测定底物的转化产物的浓度来定量测量。
酶催化底物转化的化学反应将会生成可定量测量的信号。
最常见的信号是颜色的变化，可以通过酶标仪来测量。
该信号与目标物质的存在和浓度之间存在正相关关系。
需要注意的是，ELISA虽然是一种高度敏感和特异的技术，但也可能受到一些因素的影响，如样品处理、试剂质量、特异性抗体的选择和结合等。
因此，在进行ELISA实验时，科学家需要严密地进行实验设计和标准化操作，以确保结果的精确性和可靠性。
elisa的基本原理方法类型及应用
Elisa的基本原理、方法类型及应用概述Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用于生物化学和生物医学研究领域的实验技术。
它利用酶标记的抗原或抗体与待测物相互作用并生成可读出的信号，从而达到检测和定量分析的目的。
本文将介绍Elisa的基本原理、方法类型及应用。
基本原理Elisa的基本原理是通过特异性抗原与抗体间的结合反应来检测和定量分析待测物。
其基本步骤如下：1.固定：将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板、膜等）上，形成固定相；2.实验样本加入：加入待测物样本到固相载体中，使待测物与固定的抗体或抗原发生特异性结合；3.洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质；4.酶标记的抗体或抗原结合：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物发生反应；5.洗涤：再次洗涤以去除未结合的酶标记的抗体或抗原；6.底物添加：加入底物，通过酶催化反应生成可检测的信号；7.信号检测：利用光度计、荧光计等仪器测量所产生的信号。
方法类型Elisa通常可以分为以下几种类型：1.间接Elisa：该方法是最常用的Elisa类型之一。
它通过在固相载体上固定抗原，然后加入待测物和酶标记的抗体，最后通过添加底物产生颜色反应来测定待测物的浓度。
2.直接Elisa：该方法直接在固相载体上固定酶标记的抗原，待测物与固定的抗原发生反应后，通过添加底物测定待测物的浓度。
与间接Elisa相比，直接Elisa节省了一个环节，因此更简单和快速。
3.竞争性Elisa：该方法适用于待测物是小分子的情况。
竞争性Elisa将待测物与酶标记的抗原竞争与固定抗原结合，通过测定底物的酶活性来测定待测物的浓度。
4.逆转Elisa：该方法常用于检测体内特定抗体的浓度。
逆转Elisa是将固定抗体或抗原加入实验样本中，之后加入酶标记的待测物，最后通过添加底物的酶活性来测定抗体的浓度。
应用Elisa在医学、生物学和生化学研究中广泛应用。
以下是Elisa的几个主要应用领域：1.临床诊断：Elisa可以用于检测和诊断人体内的疾病和感染。
ELISA的基本原理
ELISA的基本原理ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)是一种常用的免疫分析技术，用于检测蛋白质、抗体、病毒、细菌和其他生物分子的存在。
ELISA的基本原理基于抗原-抗体相互作用，并利用酶的催化反应来检测目标分子的存在。
1.表面修饰：首先，将涂有目标分子（例如抗原或抗体）的微孔板或其他实验器具表面修饰。
修饰常用的方法是将目标分子溶液加入孔板孔中，并在低温下孵育一段时间，使目标分子与表面结合。
2.洗涤：将孔板洗涤，以去除未结合的目标分子。
3.加入样品：加入待测试样品（例如血清或组织液），并与目标分子结合。
目标分子可以是样品中所含的抗原或抗体。
4.洗涤：将孔板洗涤，以去除未结合的样品。
5.添加检测抗体：加入与待测分子结合的检测抗体。
检测抗体通常是与酶结合在一起的，以便通过酶催化反应检测其存在。
该催化反应将用于定量目标分子的含量。
6.洗涤：将孔板洗涤，以去除未结合的检测抗体。
7.添加酶底物：加入一种酶底物溶液，使酶与底物发生反应，并产生颜色变化。
这种颜色变化将与目标分子的存在量成正比。
常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯基二胺）或pNPP（对硝基苯磷酸酯）。
8.反应停止：在酶底物反应时间结束后，通过添加停止剂停止酶反应。
停止剂会改变溶液的pH值，阻止进一步的反应。
9.测量光密度：使用酶标仪或其他光度计测量反应溶液的吸光度。
光密度值的大小与目标分子的存在量成正比。
通过与已知浓度的标准曲线进行比较，可以确定待测样品中目标分子的浓度。
ELISA的原理基于抗原结合抗体的高度特异性，酶-底物的催化反应可产生放大的信号，从而使其可以高灵敏度地检测目标物质的存在。
ELISA具有操作简单、高通量、高灵敏度和高特异性的优点，因此得到了广泛应用。
总结起来，ELISA的基本原理是通过将目标分子与抗体结合，然后利用酶与底物的催化反应来检测目标分子的存在，最后通过测量反应产生的信号来定量目标分子的浓度。
elisa基本原理
elisa基本原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的基本原理如下：
1. 固相吸附：首先，在试验板上吸附抗原或抗体。
通常使用多孔板（如96孔板），将要检测的抗原或抗体溶液加入到孔中，然后孔中的溶液经过吸附和固定，使抗原或抗体附着在孔壁上。
2. 样品处理：将待测样品加入到试验板中，与固定的抗原或抗体发生特异性的结合反应。
如果样品中存在目标抗原或抗体，它们将与固定在试验板上的抗体或抗原结合形成复合物。
3. 洗涤：通过洗涤步骤，将未结合的物质洗掉，以去除非特异性的成分，使只有特异性结合的复合物留在孔中。
4. 酶标记：加入酶标记的抗体或抗原，它们与目标抗原或抗体发生特异性的结合。
5. 洗涤：再次进行洗涤步骤，去除未结合的酶标记物。
6. 反应物添加：加入适当的底物，使酶标记物催化反应，产生可测量的信号。
常用的底物是染色剂，其颜色与酶标记物的酶活性成正比。
7. 反应停止：加入反应停止剂，停止底物的反应，防止颜色进一步发展。
8. 信号测量：使用光谱仪或酶标仪等设备测量反应产生的信号强度。
信号强度与目标抗原或抗体的浓度成正比。
通过比较待测样品与已知浓度标准曲线的信号强度，可以确定待测样品中目标抗原或抗体的浓度。
ELISA技术在生物医学研究、诊断和药物开发等领域广泛应用，可以检测多种疾病标志物和生物分子。
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbe nt assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ELISA的基本原理[1]ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。
因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部分包括：（1）包被的抗原或抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或试管；（2）酶标记的抗体或抗原和（3）酶的反应底物等。
抗原或抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。
整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标准，显色或产生荧光或发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。
目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。
二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3]通常所提到的抗原与抗体的相互作用，一般指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。
（一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。
当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。
这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的区域内。
也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。
微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。
所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。
（二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分，这部分体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。
固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100Å。
液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要经过扩散或质量转移。
微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。
因此，结合反应的效率更高。
这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。
可参与结合反应的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积，无法精确计算这种反应体积，从而难以使用通常的质量作用定律图形来计算Keq。
因此，固相上抗原与抗体反应的Keq值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性。
（三）固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低固相免疫测定中固相表面上抗原和抗体间的相互作用，类似于细胞表面上蛋白与其受体间的结合。
研究表明，细胞表面上的蛋白与受体结合反应的离解速率较液相中的要低两个梯度，同样，固相免疫测定中，固相上抗原和抗体的离解速率亦同样缓慢，其基本原理相似，概述如下：（1）细胞表面上蛋白与其受体的相互作用涉及到细胞表面受体的聚集，由于多价复合物离解的减少，相应地亲合力增加。
研究表明，被动吸附于固相的抗原和抗体也是成簇或聚集状的，因此，反应界面的抗原或抗体可能也是“成簇的”。
（2）大多数抗原-抗体的离解所需的能量比防止其结合所需的能量要大，表明在初始结合键形成后，又形成了次级结合键。
这提示在固相免疫测定和其它细胞表面反应中，形成了大量的次级结合键。
（3）以成簇出现的和来自于限定的界面反应体积内的抗体或抗原，常以很高的浓度存在，这种情况下，即使抗原和抗体有离解发生，离解的抗原的重新结合也较液相系统更为快速。
这可以解释为何固相免疫测定与液相测定相比时，其抗体的Keq较高。
正是这种极缓慢的离解速率，使得ELISA和固相免疫测定技术具有很好的适用性，即使是测定的反复洗涤步骤，也可使受体配体的相互作用仍保持处于结合状态。
（四）微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性使用固相包被的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定，与液相测定相比，有明显的亲和力依赖性，固相受体-配体相互作用的稳定性，似乎与微孔内特异抗体的免疫测定亲和力依赖性和极低比例的所捕获的总抗体相矛盾，这可能是因为：（1）在所吸附于固相的复杂抗原中，能与液体中特异抗体结合的抗原浓度极低。
这可能是由于所吸附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结果。
（2）抗原表位由于固相吸附发生改变，使得特异抗体与其结合的亲和力较低。
当抗原以1~5 g/ml浓度被动吸附于固相时，大多数蛋白抗原的60-80%至少会以一个单层而稳定的吸附于固相，这样在固相上的总的抗原就不会缺乏。
如果500-800μng抗原稳定的吸附于微孔板孔，对含500 g/ml抗体的血清的1：10,000稀释可提供大于10倍过量的抗原，考虑到抗原和抗体间相互作用的合理的Keq，只是从吸附抗原的量的有限性，不能解释固相上抗原与抗体结合的低亲和力，而更可能是由于空间位阻或吸附引起的变性所致的抗原表位的丧失所致。
μ（五）固相的抗体或抗原与液相中的抗体或抗原在构型上不一样固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体或抗原所展示的构型不一样，对抗体或抗原由于固相化尤其是被动吸附或其它吸附方式所致的构型改变已有众多的文献报道。
本书的另一章节将有专门介绍。
三、临床ELISA测定的常用模式ELISA依其测定抗原和抗体的不同，测定模式有很多，如直接法、间接法、双抗体夹心法（直接、间接）、竞争抑制法（直接、夹心等）、捕获法等[4]。
在临床实验室，常用的ELISA测定模式有双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。
在抗原的测定上，蛋白大分子抗原测定用的最多的模式是双抗体夹心法，而对只有单个抗原表位的小分子，则使用竞争抑制法；抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。
（一）抗原测定ELISA模式1. 双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下。
（1）首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
（2）加入含待测物的临床样本如血清（浆）等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体结合而吸附于固相上。
（3）加入酶标记的双抗体之二，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
(4) 加入酶底物，温育（通常为37℃下）显色测定（图1）。
在该测定模式中，有两步温育及板孔洗涤步骤，从而称为“两步法”，如果将上述测定步骤（2）和（3）合并为一步，即将待测样本和酶标抗体在步骤（2）中同时加入，这样就只有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双体抗夹心测抗原的ELISA试剂盒，均采用“两步法”。
后来，为了缩短检测时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、甲胎蛋白（α-fetoprotein, αFP）、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、hCG及激素等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单，但有其固有的缺陷，处理不好，双抗夹心免疫测定结果会因为钩状效应（Hook effect）的存在而出现假阴性或定量偏低的结果[5-14]。
，因此待测抗原浓度的逐步增加，导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系成S形变化曲线（图2）。
]（2）式[在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原（Ag），当其浓度逐步增加时，将使固相抗体（Ab）与抗原的结合逐步达到饱和[（1）式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体（Ab*）后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关Ab • Ag （b复合物） (1)→ Ab ＋ Ag Ab • Ag→Ab • Ag＋Ab* • Ab* （a复合物） (2)而一步法双抗体夹心ELISA的抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系则为钟形曲线（图3）。
也就是说测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加，在一开始其也是增加的，而当抗原浓度升高至一定程度后，测定吸光度即开始下降，而像一个倒立的鱼钩（图2-3中钟形曲线的实线部分），即所谓的“钩状效应”（其曲线像一个倒立的鱼钩），抗原进一步增加，甚至不出现任何显色（图3中钟形曲线的虚线部分），此时，强阳性标本会测定为阴性，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”（Zone phenomenon）。
一步法的反应平衡式如（3）式。
Ab • Ag • Ab* ＋Ab • Ag ＋Ag • Ab*＋Ab* •→Ab＋Ag＋Ab* Ag • Ab* (3)a bc d其中a为最后测定结果的显色之源，当待测标本中Ag 浓度增加时，无疑会使b、c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使Ab • Ag • Ab* 即a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟形，而且由于d 复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步法显色较两步法为浅。
此外，b和c复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。
但如果固相单抗和标记单抗，采用针对抗原的不同且空间距离较远的表位的抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b、c和d复合物减少至最低程度，而大大减轻“钩状效应”。
我们曾使用本室能得到的含最高浓度（约2,000,000 ng/ml）HBsAg的血清样本，对国内较大的试剂生产厂家的“一步法” HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评价，尽管大部分试剂在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度（1:10稀释）显色要浅，在曲线上出现了“钩状”，但均未出现该份样本测定为阴性的情况。
尽管如此，在临床实验室实际工作中，仍有可能遇到“钩状效应”较严重的HBsAg测定ELISA试剂盒，基层实验室同行也有这方面的反映。
因此，还应该重视“一步法”试剂盒所致的假阴性问题，当发现测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾，如HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”所致假阴性问题。