有关物质检验方法概述

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4、其他检测方法 1）GC法：基本上通过不同色谱柱（包括填料和规格）、 温柱和流速就可以得到很好的分离，对于酸性或碱性化 合物可以考虑使用特定的色谱柱，对于一般的化合物 FID检测器就可以满足，必要的话可以使用ECD、NPD， 甚至MSD。 2）TLC法：由于也是一种液相色谱，所以思路同HPLC，重 点在于选择蒲层板填料、展开剂和显色方法，通用的硅 胶板是正相的，这与HPLC通常有的方法是不同的，可以 调节的空间也比较小。 3）滴定法和紫外法：由于方法的专属性较差，所以一般 适用于特定杂质的检测，主成分和其他杂质均不得干扰 测定；也可以测定一类杂质，比如用乙酸来代表可能存 在的各种有机酸杂质，乙醛来代表各种醛类杂质。
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4）检验条件的选择
选择合适的检验器是有关物质检验的一个重点，各种类型的 检验器都有各自的优缺点。例如紫外检验器的优点是成本低、 适用性广、操作简单，缺点是紫检验器为非质量型，各杂质 和主成分的响应值可能会差别非常大；而蒸发光散射检验器 的优点为它是质量型检验器，各杂质与主成分的响应值比较 接近，缺点是价格比较高、非挥发性流动相不能使用、检验 结果非线性。 作为最通用的紫外检验器，有关物质检验波长的选择非常关 键，这一方面决定了是否所有潜在杂质能够检出，同时也决 定了检验时是否可以采用主成分对照的方法测定（本文中所 说的对照既可指主成分对照品，也可指主成分自身对照）， 还是必须使用外标法/校正因子的方法测定特定杂质。 必要时可以使用检测器联用技术，或者使用多波长同时检测 技术来解决特定杂质的检测（一般此时适用于外标法）。
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那么哪些检测方法是限量方法？例如： 1）TLC法：典型的方法是USP<466>（一般杂 质），方法中同时配制了0.1%、0.5%、1% 和2%的对照品溶液，供试品所示斑点与对 照品各斑点比较，可以分别报告成<0.1%、 <0.5%、<1%和<2%，需要时可以进行加和和 乘积，不等号方向不变。 2）UV法、滴定法等：只给出了限量的吸收值 或滴定体积，这时即使你知道计算公式也 不需要计算。
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2）色谱柱的选择
根据主成分和杂质的化学性质，选择合适的色谱柱， 使其能够尽可能在一个色谱条件下检验所有杂质。 在选择时往往极性强化合物选择极性色谱柱、极性 弱的化合物选择非极性色谱柱，但由于成本和环保 的原因，除极性非常强的化合物外（例如糖），一 般我们首选非极性色谱柱（例如C18）。 即使相同类型的色谱柱，由于品牌、规格、型号等 差异，色谱柱的保留行为可能会有很大差异，因此 在检验时应尽可能固定这些参数，尤其是规定有相 对保留时间的和梯度的色谱条件。
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5）校正因子和相对响应因子
通常只有校正因子在0.9～1.1 时才可以使用主成分 对照的方法（国外由于有关物质标准制定得比较严 格，所以校正因子在0.8～1.2 时仍可以使用主成分 对照的方法），校正因子超过此范围的杂质应选择 外标法或校正因子的方法测定。 校正因子一般是通过同时进行杂质和主成分的线性 测定（线性浓度范围通常是从报告阈值或定量限到 杂质限度或对照浓度的120%～150%），再用主成 分的斜率除以杂质的斜率而得出，在计算时将杂质 峰面积与校正因子相乘即可。 校正因子的概念与EP 中的概念相同，与USP 中的相 对响应因子互为倒数，因此在使用中一定要注意。
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其次是，有关物质HPLC 检验方法在建立时需考虑 到在该色谱条件下是否所有潜在的杂质都能被检出、 各杂质的响应值是否合适、有关物质与含量之间的 质量守衡（Mass Balance，即理论上含量降低多少 有关物质就应该增加多少）。 第三是，很多人在有关物质检验方法建立时参考的 是含量测定甚至是血药浓度测定的方法，往往这是 不合适的，因为这些方法都是针对主成分的测定方 法，它不会去考虑杂质的检出情况和准确性，只需 要不干扰主成分的测定即可，而且往往在含量测定 的浓度下杂质不能够检出，因此无论是流动相的组 成还是检验波长，可能都不适合有关物质的测定。
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3）流动相的组成
流动相的组成往往取决于色谱柱的选择，在色谱柱 选定后，通过调节流动相中的组分及其比例、pH 值、缓冲盐（包括离子对）的种类/浓度等条件， 使主成分和杂质能够分离并在一个条件下检验，必 要时应使用梯度。 缓冲盐，特别是阴离子对试剂，各厂家的质量差别 比较大，因此在使用时应尽可能使用固定的可靠的 品牌。 在使用梯度检测时，流动相中由于水和试剂中残留 的微量杂质会在色谱柱中保留，并在梯度极性变化 后流出，进而产生鬼峰，因此应尽量选择高纯度试 剂和水，尤其是梯度极性变化较大的。
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最后，由于制剂有关物质的检验重点是降解物 和相容性产物，因此原料药生产工艺杂质（包 括原料、中间体、副产物等），如果不是降解 物的话，都不是制剂有关物质重点关注的内容 （ICH Q3B），甚至可以不订入制剂的质量标准 中。再加上可能存在的辅料干扰，因此制剂有 关物质的检验方法很可能与原料药会有所不同， 不能不加考虑地拿来主义，这时需对原料药中 可能存在的工艺杂质进行重新定位，这也是方 法建立和专属性验证的一部分。
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6）浓度的选择
根据ICH Q3A/3B的要求，报告阈值（最大日服用量2g以上的 为0.03%，否则为0.05%）应不低于定量限（也就是说要求报 告的杂质必须能够定量检测），如果报告阈值为0.05%，那 么供试液的浓度至少是定量限的2000倍。 由于仪器、人员、试剂、环境等都对定量限测定结果产生影 响，甚至是数量级的（比如高压和低压泵），所以有必要加 上一个安全系数，例如10或更高。 任何线性都是有范围的，比如紫外原理，在高吸收下受杂散 光影响使响应值降低，低吸收下受噪音影响使吸收值升高。 所以我们所说的线性在高、低温度下的低斜率是不同的，适 当地提高供试品溶液的浓度可以减少在定量限到限度级别下 测定的准确性，无论是校正因子计算（线性斜率）还是回收 率的计算。 当然浓度太高，可能又会带来溶解性的问题，尤其是制剂产 品，甚至可能会带来准确性的影响（因为辅料可能太多）。
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鬼峰案例（摘自小木虫网友提问）： 液相条件：agilent 二元泵，梯度洗脱，其中缓冲液配制方法如下： 缓冲液＝（7.8g NaH2PO4+4ml 三乙胺+1.2g 十二烷基硫酸钠， 加水至1000ml，调pH3.0）/乙腈（90/10） 乙腈： 缓冲液 0min 28 72 5min 28 72 45min 58 42 50min 28 72 60min 28 72 该条件下，在约30.5min出现鬼峰，且一直出现（进空白溶剂、 样品等均出现），如图，波长260nm，流速：1.0ml/min，柱温 35摄氏度，色谱柱：C18 5 um 250×4.6mm。
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3、HPLCBiblioteka 检测有关物质方法的建立 1）前提说明
首先需要说明的是，任何一种检验方法都不是万能的，HPLC 法也是一样，一般有两个大的缺陷：一是HPLC 检验的图谱 不是一个“全谱”，也就是说一个HPLC 方法并不会像TLC 方 法一样把所有的杂质都会同时检验出来，尤其是国内现在使 用较多的恒流的色谱方法，极性相差较大的化合物很难在一 个色谱条件下检出；二是有一些杂质在检验条件下没有响应， 例如一些化合物的原料/中间体/副产物没有紫外吸收，使用 紫外检验器是无法检验到的。因此在建立有关物质的检验方 法时，往往需要针对不同的已知杂质建立特定的检验方法， 作为有关物质检验方法的补充，这个方法即可能是HPLC 法， 也可能是TLC 法，甚至可能是紫外法或滴定法等等，需要说 明的是，对于此类杂质在总杂质计算中不应被重复计算。
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2、国外药典方法借鉴的意义
自己做的杂质分析可能考虑得不周全，可能会导致 有的极性相差较大的杂质/潜在杂质被漏检。 自己设定的检测波长可能不合适，可能会导致杂质 测定结果偏低，甚至有的杂质检测不到。 一些特定的有安全性问题的杂质，例如甲磺酸酯类， 我们可以按照国外药典制定标准，以避免标准制定 过于宽松。 国外药典提供了色谱条件和参考的色谱柱信息，减 少了我们方法摸索的时间。 药典未收载的品种，可以从同类品种中找出我们样 品中潜在的杂质。
所有存在的或潜在的杂质分析 将杂质进行分类，根据可检测的手段 拟定不同的检测方法，例如HPLC、GC、滴定等， 对于非专属性方法重要的一点是主成分不得干扰测 定。 一般性原则：有紫外吸收的首选HPLC法，无紫外吸 收的可以选择TLC法，液体无紫外吸收的首选GC法， 有机酸可以选择滴定法，只是特写杂质有紫外/可 见吸收的可以选择UV-Vis法. HPLC法对于有弱极性杂质的首选梯度的方法。
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3）ICH Q3A 和Q3B 两部分均有描述，定量限 不得高于报告阈值，即需要报告的杂质具 备定量的条件。ICH Q3A 和Q3B 两部分对于 杂质的描述，对于数据的最终报告（这部 分的将在后面进行阐述），均采用数据的 方式，应为定量计算而得出的。
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4）USP 等国外药典中要求未知杂质的限度为 不得过0.1%，ICH Q3A 和Q3B 也要求超过鉴 定阈值（一般为0.10%）的杂质必须鉴定， 检验时必须采取先修约后判定（0.10%和 0.1%的意义是完全不同的），这是限量法 所不需要而且也做不到的。 5）USP<621>（色谱法）和EP2.2.46（色谱分 离技术）对于有关物质的积分、计算和报 告，也说明了其检验方法应为定量的。
HPLC法（最常用的方法，本章的重点） GC法（例如乙醇的挥发性杂质） TLC法（一些小分子化合物例如哌嗪等） UV法（例如葡萄糖注射液的5-HMF） 滴定法（例如还原糖） 衍生化法（衍生化后用HPLC/UV等方法检测）
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一、定量方法还是限量方法 典型的定量法的描述：按**法计划，含杂 质A不得过0.1%。 典型的限量法的描述：供试品溶液色谱图 中杂质A的峰面积不得过对照溶液主峰的峰 面积（0.1%）。 中国药典和国外药典中很多品种有关物质检 测中都是第二种描述方法，那么我们就按 照限量要求可以吗？