微生物实验思考题参考答案及知识要点
食品微生物学实验思考题
实验一显微镜的使用和细菌简单染色六、思考题1.用油镜观察时应注意哪些问题？由于油浸镜的工作距离很短(0.19mm左右)，故使用时必须特别小心。
在低倍镜找到要观察的部位以后，将镜筒升起，在标本上加一滴香柏油，转换油镜头，从侧面注视，用粗调螺旋将镜筒小心下降，使油镜头浸入油滴，直到几乎与标本接触为止(注意切勿压在标本上，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。
从目镜观察，先用粗调螺旋徐徐升起(只准上升镜筒，不能向下调节)，当视野中有模糊的标本物像时，改用细调螺旋调节，直到标本物像清晰为止，如转动粗调螺旋已使镜头离开油镜，应重新调节，直至调到看清物像为止。
3.什么是物镜的同焦现象？一般情况下，当五项在一种物镜中已清晰聚焦后，转动转换器将其它物镜工作时，物像基本保持在聚焦状态。
实验二革兰氏染色法六、思考题1．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？菌龄、图片厚度、染色均匀度、脱色时间、脱色均匀度等。
其中脱色时间是关键。
2．革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老？为什么？菌龄太老，其中的部分细胞可能已经死亡或自溶，造成细胞壁的通透性增强，染色结果可能出现假阴性。
3．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？不能。
初染前加碘液的话就会先和染料结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞壁进入细胞质膜，达不到初染效果。
4.不经过复染，能否区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌？可以。
因为脱色后G+是紫色的而G-是无色的，所以已经可以区分了。
但是如果不经复染的话，镜检时看不清G-的细胞形态。
5.制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？涂片、固定、脱色6.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？因为如果制片和油镜镜头之间有水层，透过载玻片的光线就会发生折射而不能完全进入镜头，从而降低视野的亮度；另外，由于水层的折射，会降低显微镜的分辨率，造成图像不清晰。
7.如果图片未经热固定会出现什么问题？加热温度过高、时间过长又会怎样？实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察六、思考题1．酵母菌死活细胞观察中，美兰液有何作用？美兰的氧化态为蓝色，还原态为无色。
微生物实验思考题
微生物实验思考题微生物学实验是生物学实验中较为复杂和繁琐的一类实验，它涉及到的实验类型和实验方法较多，而且每一种实验类型和实验方法都有其自身的特点和操作要求。
本文将从以下几个方面对微生物学实验中的一些常见问题进行思考和探讨。
一、实验前的准备工作在进行微生物学实验之前，我们需要做好充分的准备工作。
要了解实验的目的、要求和原理，确定所需的实验器材和试剂，并准备好相应的实验用品。
要对实验场所进行清洁和消毒处理，确保实验环境的无菌性。
要根据实验要求选择合适的菌种和培养基，并进行必要的预处理。
二、实验过程中的注意事项1、菌种保藏：在进行微生物学实验之前，需要对菌种进行保藏。
保藏方法应根据菌种的性质和实验要求进行选择。
常用的保藏方法有甘油管藏法、沙土管藏法、液体石蜡法等。
保藏过程中需要注意防止杂菌污染和防止菌种变异。
2、培养基的制备：制备培养基是微生物学实验中的一项基本操作技能。
在制备培养基时，需要注意根据菌种的营养需求和实验要求选择合适的配方和配制方法。
同时，要注意对培养基进行灭菌处理，确保无菌性。
3、接种与培养：在接种和培养过程中，需要注意无菌操作和防止杂菌污染。
接种时需要根据实验要求选择合适的接种方法和接种量，并注意对菌种进行纯化处理。
培养过程中需要注意控制温度、湿度、光照等环境因素，以保证微生物的正常生长和繁殖。
4、观察与记录：在观察和记录过程中，需要注意对微生物的生长情况、形态特征、生化反应等进行仔细观察和记录。
这些信息对于后续的数据分析和实验结果解释非常重要。
5、数据分析与总结：在完成实验后，需要对实验数据进行统计和分析，并将分析结果进行总结。
数据分析可以借助专业的统计软件进行，如SPSS、Excel等。
总结时需要注意对实验结果进行客观评价，并提出改进意见和建议。
三、实验后的整理与思考完成微生物学实验后，需要对实验场所进行清洁和消毒处理，并对实验器材和试剂进行整理和存放。
需要对实验数据进行整理和分析，并将分析结果进行总结和评价。
微生物实验思考题参考标准答案及知识要点
微生物实验思考题参考答案及知识要点一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。
因此,具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色,借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
美蓝浓度高了,代谢不太活跃的活细胞也会被染色,从而使观察到的死细胞较多,活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝,不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。
二.细菌的简单染色和革兰氏染色1.革兰氏染色中那一步是关键？为什么？你是如何操作的?革兰氏染色的关键步骤是:乙醇脱色(是脱色时间）。
如果脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s)。
2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同?自然死亡的菌体本身已经部分自溶,结构已经改变。
固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
３. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。
在酒精脱色后,不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋),被酒精脱色为革兰氏阴性菌。
最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4．涂片为什么要固定,固定适应注意什么问题?a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上;b增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片,菌膜朝上,在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜),固定时应尽可能维持细胞原有形态,防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察1．镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状,比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮,可看到横隔膜,继而断裂成球状或杆状小体。
微生物学思考题答案
微生物学思考题答案1、你如何使你的朋友相信微生物不仅仅是一种病原？尽管目前微生物仍在严重威胁人类的生存，但另一方面，我们必须强调，大多数微生物对人类是无害的。
事实上，大多数微生物对人类社会还有巨大的价值。
整个农业系统在许多方面都依赖微生物的活动。
许多主要的农作物属于豆科植物，它们的生长同专一性细菌紧密相连，这些细菌可在植物的根部形成根瘤结构。
根瘤结构中，大气中的氮转变成可用于生长的氮化物。
根瘤细菌的固氮活动，减少了昂贵肥料的需要。
微生物在农业上的另一个重要性在于，某些动物是反刍动物，这些主要的农业动物具有瘤胃，微生物在瘤胃中进行消化。
没有这些微生物牛羊的饲养是不可能的。
植物营养方面，微生物在碳、氮、硫这些重要营养成分的循环起着关键作用。
土壤和水中的微生物可见这些元素转化成植物容易利用的形式。
微生物与食品的关系，不仅仅是产生腐败变质等不利影响。
奶制品的制造至少部分是借助微生物的活动，包括乳酪、酸乳酪和黄油，都是主要的具有经济价值的产品。
泡菜、腌制食品和一些腊肠也归功于微生物的活动。
可烘焙的食品及乙醇的制造也基于酵母菌的发酵。
微生物在能源生产方面也起着重要作用。
天然气是细菌作用的产物，由甲烷细菌代谢产生。
光营养的微生物能够收集太阳能生产生命有机体中的储存物――生物量。
废物如生活垃圾、剩余谷物、动物废料等通过微生物转化微生物燃料――甲醇和乙醇。
利用微生物清理被人类活动污染的大气――生物整治。
利用微生物降解油污、溶剂、杀虫剂和其他环境污染物。
通过基因操纵技术，能在微生物种生产出人类胰岛素。
利用基因组学方法搜索带几百个目的蛋白的基因蓝图，然后将它们转入到合适的受体中由于生产重要的、有商业价值的蛋白质。
在自然界中，它无限小，但作用无限大。
2、胡克和列文虎克对微生物学的贡献有那些？科恩对微生物学的贡献有那些？1665年，罗伯特.胡克描述了霉菌的子实体结构，因此他是第一个描述微生物的人。
1676年，列文虎克在研究辣椒水渗出的过程中发现了细菌，因此他是首次描述细菌的人。
微生物思考题及参考答案
微生物思考题及参考答案１、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片与镜头之间加滴什么油？起什么作用？答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验得污染、操作时，先低倍再高倍、用完要擦掉油、加香柏油,作用就是增加折光率,也就就是增加了显微镜得分辨率、油得折光率与分辨率成反比（有公式)，同时与波长成正比、２、什么就是物镜得同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义?答:在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其她物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦得状态，这种现象称为物镜得同焦。
利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短得物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能得误操作而损坏镜头或载玻片。
3、影响显微镜分辨率得因素有哪些?答：物镜得NA值(物镜得数值孔径）与照明光源得波长、４、美蓝染色液作用时间得不同,对酵母菌死细胞数量有何影响，试分析原因答：会造成更多得死细胞，在显微镜下观察,活得就是透明无色，衰老得就是淡蓝色，死亡得就是蓝色,如果美蓝染色液作用时间过长,会造成细胞脱水死亡并渗透染液，影响实验结果。
5、镜检时如何区分放线菌基内菌丝，气生菌丝以及孢子丝一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮,可瞧到横隔膜,继而断裂成球状或杆状小体.6、在进行细菌涂片时应注意哪些环节１、载玻片应该冷却后再涂片. 2、如果就是涂布液体，可以用毛细管或接种环滴一小滴，然后轻轻抹开,一圈足够. ３、如果就是涂布菌落或菌苔,应该在载玻片上先滴一滴水,再将菌落或菌苔涂布上去，接种环得尖蘸一点点即可。
4、为了节省时间，可以将干燥与热固定合并成一步。
但就是应该避免高温,因为温度一高，细菌会变形。
5、染色时间视染色液种类而定。
如结晶紫只需几十秒，亚甲基蓝则需一到两分钟。
6、冲洗时，水流不能太大,而且尽量避免水流直接冲在涂片上。
微生物实验报告思考题参考答案
实验一、微生物的简单染色思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？答：油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。
油镜使用过程中要注意两点：（1）、使用后镜头的清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”（观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原）。
（2）、.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。
当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
2、使用油镜时，为什么必须用镜头油？答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？答：低倍镜视野比较大，能看到的范围大，容易找到观察的目标，然后在用放大倍数高的高倍镜或油镜有目的的观察。
实验二、革兰氏染色（1）为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏染色？答：24h以内的菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄的革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性（2）要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？答：应注意如下几点：其一，选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性；其二，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；其三，脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性（3）当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？答：当要确证未知菌的革兰氏反应时，可用已知菌进行混合涂片，使二者染色条件保持一致，如果已知菌的结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。
微生物学实验原理及思考题答案
微生物学实验原理及思考题答案第一篇：微生物学实验原理及思考题答案油镜便于观察的原理是什么?用油镜观察时在油镜与载玻片之间加入了和玻璃折射率相近的香柏油，使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。
1.细调节器每旋转一周使镜筒上升或下降0.1mm.一。
培养基的配制原理：微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养物，为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配制好以后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物实验。
一次培养基的配制和灭菌是微生物实验室中最基本的操作，通过本次实验学习微生物实验室中常用培养基的配制方法和灭菌方法。
1.称药品的钥匙不要混用称完药品应及时盖紧瓶盖，因为某些成分如蛋白胨极易吸水潮解调PH时要小心操作，避免回调。
配制培养基应注意哪些问题？要选定合适的培养基;培养基成分要称量准确；PH要适宜；灭菌要严格。
培养基配制完成后为什么要立即灭菌？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？防止细菌污染培养基一旦细菌污染了培养基，由于培养基有丰富的营养物质，细菌会段时间内大量产生这样子就会跟培养物争夺营养物质，另一方面，细菌生长过程中会产生有毒物质致使培养物死亡。
放在37℃的恒温箱中一两天后，培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见）二。
细菌的单染色技术原理：单染色法师利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而使细菌着色。
制备染色标本时的注意事项？选择合适菌龄的细菌；固定时避免火焰直接烘烤破坏细菌形态；染色时间要适宜；水洗时水不能直接冲在涂片处。
制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？油和水之间会分层，油就不能与标本接触还有光会发生折射等等原因，这样不利于油镜观察三。
细菌的革兰氏染色法原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，为G+，有的可被脱去，为G-.1.革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。
医学微生物学思考题及答案
微生物思考题及答案1、何为硫磺样颗粒，有什么临床意义？答在患者病灶组织和瘘管中流出的脓汁中，可找到肉眼可见的黄色小颗粒，称硫磺颗粒，这种颗粒是放线菌在组织中形成的菌落。
用于放线菌的微生物学诊断。
（P184）2、简述白喉外毒素的产生、作用机制。
答当b棒状杆菌噬菌体侵袭无毒白喉棒状杆菌时，其编码外毒素的tox基因与宿主菌染色体整合，无毒白喉棒状杆菌则成为产毒的白喉棒状杆菌而产生白喉毒素。
作用机制：此毒素是一种毒性强、抗原性强的蛋白质，由A和B 肽链经二硫键连接而成。
A肽链是白喉毒素的毒性功能区，抑制易感细胞蛋白质的合成。
B链上有一个受体结合区和转位区，但能和心肌细胞、神经细胞等表面受体结合，协助A链进入这些易感细胞。
细胞内蛋白质的合成过程中，需要延伸因子1和延伸因子2.当白喉毒素A链进入细胞后可促进辅酶I上的腺苷二磷酸核糖与延伸因子2结合，结果延伸因子2失活，使蛋白质无法合成。
（P174）3、简述结核分枝杆菌形态染色，生长特点。
答形态染色：细长略带弯曲杆菌，齐-尼抗酸染色法阳性。
生长特点：生长缓慢，3-4周后可见颗粒、结节或菜花状，乳白色或米黄色菌落，不透明。
（P150）4、简述结核菌素试验的原理，结果判断及意义。
答原理：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发性超敏反应（Ⅳ型变态反应）从而判定机体对结核有无免疫力的一种试验。
结果判断及意义：阴性反应：无硬结者或直径小于5mm,表示未感染过结核分枝杆菌，也未曾接种过卡介苗。
阳性反应：直径大于5mm,表示感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗，机体对结核分枝杆菌有一定的免疫力。
强阳性反应：直径大于15mm,表示体内可能有活动性结核感染。
（P153）5、简述结核分枝杆菌原发感染与原发后感染的特点。
答原发感染：多发生于儿童；原发综合征：原发灶、淋巴管炎、肺门淋巴结肿大；转归原发后感染：多发生于成人，多为内源性感染；病灶多局限，易形成结核结节，发生开发性肺结核的机率大（P152）6、支原体的定义。
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微生物实验思考题参考答案及知识要点一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
美蓝浓度高了，代谢不太活跃的活细胞也会被染色，从而使观察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。
二. 细菌的简单染色和革兰氏染色1.革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。
如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。
固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3.不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。
在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。
最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4.涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过 3 次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察1.镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。
2.显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。
细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。
（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。
酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。
菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。
霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。
四. 玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌1.高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“ 0”时，才能打开排气阀，开盖取物？因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
如果压力未降到0 时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡（压力突然下降而发生复沸腾）而冲出烧瓶口或试管口，造成培养基等液体沾湿棉塞或溢出等事故。
2.设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌的效果。
以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则。
（一）实验材料试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 7053 菌片纸片（与菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）。
（二）对照组取 9 支洁净试管，分为A1 B1 C1 三组（每 3 支一组），将 A1 组中放入菌片，B1 组中放入纸片，C1 组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。
（三）实验组取 18支洁净试管，分为 A21 A22 B21 B22 C21 C22 六组（每 3支一组），将 A21 A22组中加入菌片，B21 B22 中加入纸片，C21 C22 中什么也不加；其中 A21 B21 C21 进行 160℃ 2 小时干热灭菌；其中 A22 B22 C22 进行 121℃20 分钟湿热灭菌，灭菌完毕，冷却后加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。
（四）恒为培养将上述所有试管按分组在56℃恒温条件下培养48小时。
（五）结果处理将培养后的结果进行记录，制表进行比较，得出灭菌效果。
（六）重复试验多次（10 几次）重复以上实验步骤，得出普遍结果。
3.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？在湿热条件下，有水蒸汽的作用：a 高温水蒸汽导热比干空气要快；b 高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；c 高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；c 高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。
（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每1 克水在 100℃时，由气态变为液态时可放出2． 26kJ（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
）五. 培养基的配置1.配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面易出错的步骤有：a 称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取；b 加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。
）；c 分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。
2.配制培养基的一般原则是什么？a 目的明确b 营养协调c 理化适宜d 经济节约六. 平板菌落计数法1.平板菌落计数法的原理是什么? 它适用于那些微生物的计数？平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3 或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
现在常使用菌落形成单位）。
平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对）。
通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
2.菌落样液移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？出现的结果是：形成菌落过于集中，不能形成均匀分布的单菌落，导致无法计数。
因为：若不立即摇匀，菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。
3.要获得本次试验的成功，那几步最为关键？为什么？a 稀释菌液若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不准确，从而导致计数误差（放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差大。
）；b 稀释倒平板 1 若再加入菌液不立即倒入培养基，可使菌体黏附于皿底；2若不注意培养基温度，温度过高会将菌体烧死，温度过低会使培养基一倒入立即凝固，从而菌体不能均匀分布；3倒入培养基需立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性；4选择倒平板的稀释梯度也是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板后所出现的平均菌落数在 50 个左右为宜，否则要适当增加（或减少）稀释度加以调整。
4.平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺点？微生物显微镜直接计数法随机性大,所以对菌体数量不能做出较为宏观,全面的反应.显微镜直接计数法一般与血球计数板配套使用.但显微镜直接计数法的优点是快速,观察到马上可以计数，而计的是相应微生物总数。
平板菌落计数法最大的缺点是速度慢, 需要平板上长出菌落一段时间后才能计数.但是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释, 所以计数的线性范围大.由于是菌悬液涂布, 所以比较均匀 , 能较好的反应菌落的疏密程度. 重复性 , 平行性很好, 而计的是活菌数。
是经典的计数方法.七. 显微镜直接计数法1.为何用血细胞计数板可计得样品总菌值？叙述其适用范围。
a 计数室体积一定；b 在显微镜下，不经染色不能分辨菌体的死活，使计数所得的数目为一定体积内的总菌数，从而计得样品中总菌值。
适用范围：可单细胞存在的细菌酵母菌或显丝状生长的真菌，放线菌所生的孢子等。
2.为什么计数室内不能有气泡？试分析产生气泡的可能原因。
a 气泡会占据计数室的空间，导致计数室中的菌体个数计数偏小，最后导致计数结果偏小。
b 计数室内的气泡，可影响菌液的随机分布，使计数产生误差。
产生气泡原因： a 操作不当，先放菌液再盖盖玻片； b 计数室洗涤不干净； c 盖玻片移动，造成空气进入而产生气泡。
3.试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施？1、仪器误差：所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕。
2、计数室内可能有气泡。
因为酵母细胞并没有染色，看起来是透明的，有气泡很容易被计入，使数值偏高；并且，气泡会影响菌悬液的随机分布。
改进：若产生气泡，则用吸水纸吸出。
3、菌体在计数板上分布不均，当用选取 5 格计数时，会造成很大误差。
改进：应使菌液自然流入并混匀，进行观察时尽可能多数几个格子。
4、配制稀释液时吸取的浓度过高或过低，导致稀释液浓度和原液不成正确比例，计算时产生误差。
应将原液摇晃均匀后取中部的液体进行稀释。
5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致的视觉误差。
应多人观察，取记录平均数。
6、计数时可能将格四周的菌都计算在内了，使数值偏高。
改进：谨遵一个规则，计上不计下，计左不计右，不可以重复计数。
7、可能出现有出芽的酵母菌，将出芽的酵母菌按两个计数了，使数值偏高。
改进：计数时，只有当芽体于母细胞一样大的时候，才能计为两个。
8、微量移液器的最小量程太大，在加样时，容易加多，使盖玻片鼓起，血球计数板所技术的体积变大，最终结果偏大。
改进：用量程的小的微量移液器并少加一些。
八. 微生物的纯培养技术1. 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出实验方案（产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。
以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件一材料准备1土壤【有机质（特别是蛋白质）含量丰富的土壤】2灭菌生理盐水（0.85%NaCl）3灭菌移液管4添加酪素的 B — 4（牛肉膏蛋白胨完全培养基）经灭菌5B — 4 斜面（经灭菌）6其他材料：接种环酒精灯等二操作方法1在盛有 10ml 灭菌生理盐水的烧杯中添加1g 土壤，配成悬浮液；2稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成 10^4— 10^6 倍的稀释液；3用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法）将其接入添加酪素的B — 4平板上；4在 55— 65℃下培养 1 — 2 天；5挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直径 D 与菌落直径 d 之比较大者），转接入 B— 4 斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验）6将 B— 4 斜面上的菌落再用平板纯培养，依次重复2—3 次后即可得到纯培养（镜检）；7纯培养细菌中蛋白酶的提取及活性鉴定【摇瓶培养（若提取蛋白酶及其活性正常，则纯培养成功，否则，重取土样重复以上实验）】。