放线菌的选择分离培养
放线菌选择性分离方法综述
１ 样 品来 源的选 择
绝 大多 数 的放 线菌 来源 于土壤 。但近 年来 ， 们将 人 目光投 向各 种生境 放 线 菌 的分 离 ， 括海 洋 放 线 菌 、 包 极 端 环境 放线 菌 、 内生 放 线 菌¨ 沙 漠 土 壤 等 。分 离 。、 放 线菌 新生 态 系统 调 查 对 于发 现 新 的放 线 菌 以及 最终 发
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｉ ａ ｔ ｌ ｎ ｒ ｄ ｃ ｓ ｓ ｖ ｒ ｌ ｅｅ ｔ ｅ ｉｏａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｃ ｉｎ ｃ ｔ ｓ ｉ ｅ ｅ ｔ ｙ ａｓ ｉｃ ｕ ｉｇ ｓ ｍｐ ｓｒ ｃ ： ｈ ｓ ｒｉ ｅ ｉｔｏ ｕ ｅ ｅ ｅ ａ ｃ ｓ ｌｃ ｉ ｓ ｌｔ ｔ ｏ ｓ ｆｒ ａ ｔ ｍｙ ｅｅ ｎ ｒ ｃ ｎ ｅ ｒ ， ｎ ｌ ｄ ｎ ａ ｌ ｖ ｏ ｏ
菌落数 高 １． ％和 ８９ 。 １２ ．％
范丽霞 等 对最有 利 于土壤 放线 菌分 离 的 ｒ 然 Ｉ ｌ 时 间展 开 了研究 。研究 结果 表 明 ： 土样 放置 ７ｄ和 ２ ｌｄ均
及 加热 与化学 物质 预处 理土样 对放 线 分 离效 的 影响 ，
以期 提 高放线 菌检 ｌ 率 。采 用涂 布 平 板 稀 释法 进 行 放 线 叶 Ｉ 菌 的分 离 ， 为达 到更好 的分 散效果 ， 物理机 械 （ 玻璃 珠抓 荡
已知生 物活性 代谢 产物 的放线 菌 。
ｒｅ ｍ ｅ ｔｃ ｌｉａｉ ｎ，ｅｃ． ｉｈ ｎ ｕｔｖ ｔｏ ｔ
Ｋｅ ｒ ｓ Ａｅｉ ｏ ｃ ｔｓ Ｉｏａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｄ ； ｕ ｙ ｗｏ ｄ ： ｔ ｍｙ ｅｅ ；ｓ ｌ ｔ ｔ ｏ ｓ Ｓ ｍｍａ ｉ ｔ ｎ ｎ ｏ ｒｚ ｉ ａｏ
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养实验报告课程名称：环境微⽣物学实验实验类型：综合实验实验项⽬名称：微⽣物的分离与培养与菌落观察学⽣姓名：专业：环境⼯程学号：同组学⽣姓名：指导⽼师：实验地点：实验⽇期：2018 年 10⽉16⽇⼀、实验⽬的和要求1.掌握微⽣物接种培养技术2.掌握微⽣物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察⽅法，认识并理解它们的形态特征。
⼆、实验内容和原理⼟壤是微⽣物⽣活的⼤本营，是寻找和发现具有重要价值微⽣物的主要菌源。
在不同⼟壤中，各类微⽣物的数量千差万别。
为了分离获得某种微⽣物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗⽣素抑制不需要的微⽣物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微⽣物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接⾄新鲜平板上，即可使⽬的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微⽣物群体中获得只含有某⼀种或某⼀株微⽣物的过程称为微⽣物分离与纯化。
在分⼦⽣物学的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“单⼀性”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
2.平板涂布法：因为将微⽣物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采⽤稀释倒平板法也会使⼀些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧⽓⽽影响其⽣长，因此在微⽣物学研究中常⽤的纯种分离⽅法是涂布平板法。
⽤途上，⼀般多⽤于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进⾏分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微⽣物的⽅法是平板划线法，其原理是将微⽣物样品在固体培养基表⾯多次作“由点到线”稀释⽽达到分离⽬的的。
划线的⽅法很多，常见的⽐较容易出现单个菌落的划线⽅法有斜线法、曲线法、⽅格法、放射法、四格法等。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
放线菌的选择培养基
高氏一号合成培养基的制备、土壤中放线菌的分离实验材料：培养基成分：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。
实验内容：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。
这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
分离放线菌常用稀释倒平板法。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。
再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
实验步骤：1.高氏一号合成培养基的制备先将可溶性淀粉称好，在小烧杯内用50~100ml水调成糊状，再在另一容器内加入900~950ml热水，将小烧杯内淀粉倒入混匀。
再分别称取其它药品，并加热搅拌使之溶解后，调pH至7.2~7.4，分装，0.1Mpa（15lb/in2）15~30min高压蒸汽灭菌。
2.土壤中放线菌的分离（1）取9套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。
每个稀释度做三个培养皿。
然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。
（2）将土样放入用酒精擦拭过的乳钵中，除去石块、草根、研磨压碎后，称取5g，放入盛有45ml无菌水的三角瓶中。
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离
分离土壤中的放线菌的步骤如下：
1. 准备培养基：选择适合放线菌生长的培养基，常用的包括土壤提取物富集培养基、葡萄糖琼脂糖培养基、镜菌素琼脂糖培养基等。
2. 取样：在选择好的采样地点，使用消毒的工具（如消毒棉签或无菌铲子）采集土壤样品。
注意避免土壤样品的污染。
3. 预处理：将采集到的土壤样品放入无菌研钵中，加入合适的无菌生理盐水或者缓冲液，悬浮土壤样品，使放线菌被更好地释放出来。
可以对土壤样品进行稀释处理，以降低微生物密度。
4. 稀释平板法：将预处理好的土壤样品用无菌移液管分别
在培养基平板上均匀涂布。
然后放入恒温培养箱进行培养。
孵育时间一般为3-4周。
在培养箱内，放线菌会产生菌落
形成。
5. 单菌分离：在培养箱内观察到单个的放线菌菌落后，使
用消毒的工具将其分离到新的培养基上，形成纯种菌落。
这一步可以采用传统的传代分离法或微量分离法。
6. 纯种菌株保存：将得到的纯种菌株存储在适当的冻存管中，通过冻存进行长期保存。
需要注意的是，在进行上述步骤时，需要严格遵守无菌操
作的原则，避免样品或培养基的污染，以保证得到纯种的
放线菌菌株。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
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主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。
以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定放线菌的分离和鉴定实验器材：1.⼟壤材料 5 ---10cm 处⼟壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（⾼⽒Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% ⽢油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% ⼄醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成⾰兰⽒染液3( 1) 结晶紫染⾊液: 甲液结晶紫2g，95% ⼄醇20ml;⼄液草酸铵0. 8g，蒸馏⽔80ml。
甲⼄液先分别溶解，然后混合在⼀起，过滤除去残渣后装⼊滴瓶中备⽤。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏⽔100ml 先取少量蒸馏⽔加⼊碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加⼊全部蒸馏⽔，分装于滴瓶中备⽤。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%⼄醇100ml，溶解装⼊滴瓶备⽤。
4.仪器和其他⽤品⽆菌纸、带玻璃珠的三⾓烧瓶、1ml⽆菌吸管、⽆菌试管、⽆菌培养⽫⼀.⽬的要求：1. 掌握倒平板的⽅法和常⽤分离纯化微⽣物的基本操作。
2. 初步观察⼟壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微⽣物分类的基本⽅法。
⼆.实验原理：放线菌在⾃然界中主要⽣存于陆地和淡⽔中，⼟壤为这类微⽣物的主要习居场所，⽆论在种类和数量上都⽐其他地⽅繁多。
在中性或偏碱性的⼟壤和有机质等丰富的⼟壤中较多。
放线菌以孢⼦和菌丝⽚段的形式存在于⼟壤，每克⼟壤内含有数万、数⼗万的孢⼦。
放线菌的⽣活史和形态特征放线菌的孢⼦和孢囊孢⼦在适宜的环境下吸收⽔分，膨胀萌发，⽣出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体⼀般没有横隔，由于菌丝体长⼊培养基内和培养基表⾯，并纠缠在⼀起形成密集的菌落，所以⽤接种针将整个菌落培养基挑起⽽不破裂。
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3,培养
平板倒置于 28℃培养箱中培养7天,观察菌落的生长情况,菌落特征.
�
1 ,取样
三 ,操作步骤
2, 制备土壤稀释液
3, 倾注平板
4,培养
四,实验操作内容
每组所需材料:
土样,装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶1瓶,9ml无菌水两支, 1或2ml移 液管2支,2副培养皿,60ml高氏1号培养基1瓶.
实验步骤
1,制备土壤稀释液 取土样0.5g,土样热处理后,加入装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中, 室温下手摇振荡10分钟,静止5分钟,用移液管取上清液1ml(10-2)加入到9ml 无菌水稀释到10-3,同样操作稀释到10-4.注意回收玻璃珠. 用移液管分别吸取10-2原液和10-4稀释液各0.5ml于标志稀释倍数的平板上 ( 10-2原液1个平行, 10-4稀释液1个平行).
二,平板分离法
A 平板划线分离法 B 倾注平板法 C 稀释涂布平板法
1)放线菌分离常用基础培养基 2)选择性培养基
选择培养基的设计
如:高氏一号琼脂;精氨酸-甘油琼脂;葡萄糖-天冬酰胺琼脂.
a,为抑制细菌及霉菌的生长,可加入链霉素(抑制细菌)和制霉素等. b,加入重铬酸钾可同时抑制细菌和霉菌的生长;对放线菌生长无抑制作用 .
文化素质教育课程
"生命科学导论"实验
放线菌的选择分离培养
一,放线菌的选择分离培养
1 ,目的要求
从土壤中分离纯化放线菌,初步掌握微生物的土壤中放线菌最丰富,品种齐全.从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣 中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和 嗜酸性的菌种. 土壤中含有丰富的放线菌,主要是链霉菌.而链霉菌以外的其他放线 菌,如小单孢菌,游动放线菌,诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要 的产生菌.但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法 很难得到. 对样品进行风干,干热处理,培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真 菌的数量;用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法,可以分离得到更 多种类的放线菌.
2,倾注分离平板
每组2个培养皿,用记号笔在培养皿底面做好标记(10-2 1个,10-41个). 用吸管分别吸取10-2,10-4的稀释液各0.5ml放到标记好的培养皿中. 等灭好菌的高氏I号培养基冷却到60oC左右时,加入重铬酸钾溶液150ul,使得 终浓度为50ppm,倒入标记好的平板,与10-2,10-4的稀释液一起混合摇匀.
3)稀有放线菌的筛选
由于链霉菌数量占绝对优势,而且菌落在基础培养基上生长快.因此常用 的方法筛选到的多为链霉菌.而其他放线菌非常少,其他放线菌在抗生素生产 中有重要作用,因此筛选稀有放线菌工作十分重要. 世界上实验室针对各种放线菌设计有专门程序,这些程序一般都是保密的,作 为技术关键. c, SDS,苯酚处理可以减少链霉菌数量,增加稀有放线菌出现的几率. d,各种抗细菌药物可以用于放线菌的选择培养