高效液相色谱法.ppt

2019-8-12
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第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利
于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液
相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在 气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际 应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
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第二节 高效液相色谱仪
3. 梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性
的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相 的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离 效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常 压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分 别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混
高效液相色谱法
上海交通大学医学院 李 莉讲师
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第一节 概 述
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起 来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起 来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同
点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现 了自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，
级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液
固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分 离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积 和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分 与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组 分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
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第四节 液—固色谱法
易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段； 不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分 离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选 择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。 一、液固色谱法固定相
液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非 极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅
若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常 用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低 的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在 色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
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第四节 液—固色谱法
液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的 固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多 少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因 缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能
一、高压输液系统
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固 定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多赏
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第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
两类。 1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性 材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅 速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗 时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受到限制。 2. 全多孔型固定相
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
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第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
（4）化学稳定性好 （5）低粘度（粘度适中）
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第一节 概 述
综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分 析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法 已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、 医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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第二节 高效液相色谱仪
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第一节 概 述
的70 ~ 80%。
（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡 过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选 择性。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是 把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
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第二节 高效液相色谱仪
三、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱 一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱长为 10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般 为室温或接近室温。
择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选
用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
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第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。
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第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
一、固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa 的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二 氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最 广泛使用的一种固定相。
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉
动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密 封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱 渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变 化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
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第一节 概 述
气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作 条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定 差别，主要有以下几方面：
（1）应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。 对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充 而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达 几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述
剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力 的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、 液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻 色谱等类型。
三、液相色谱与气相色谱的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、 分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论： 塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相 色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和