Northern blot技术
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
Northern Blot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
展开
编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
northern blot 的主要操作流程
northern blot 的主要操作流程Northern Blot 是一种用于检测样品中特定RNA 分子大小和数量的重要分子生物学技术。
下面是Northern Blot 的主要操作流程：1. 样品准备：选择适合的样品，可以是植物、动物或微生物的总RNA 提取物，或组织匀浆液等。
将样品在沸水中加热变性，以解开RNA 的二级结构，提高检测的灵敏度。
2. 凝胶电泳：将变性后的RNA 样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据分子量大小将不同大小的RNA 分开。
电泳结束后，将凝胶放入甲醛溶液中固定，以保持RNA 分子在凝胶中的位置。
3. 转膜：将固定好的凝胶放入Northern Blot 膜上，使凝胶中的RNA 分子按照大小顺序被转移到膜上。
这一步需要使用适当的缓冲液和转移膜，以确保转移过程的顺利进行。
4. 杂交：将膜在适量的预杂交液中杂交，以封闭膜上的非特异性位点。
然后，将杂交液中的探针加入到膜中，使探针与目标RNA 分子特异性结合。
5. 洗膜：在洗膜液中清洗杂交后的膜，以去除未结合的探针和其他杂质。
这一步需要使用适当的洗膜液和温度条件，以确保特异性杂交的信号被保留下来。
6. 检测：将杂交后的膜置于放射性自显影液或化学发光试剂中曝光，以检测目标RNA 分子杂交信号。
通过显影或发光信号，可以观察到特定大小的目标RNA 分子是否存在，并比较其相对丰度。
7. 数据分析：对Northern Blot 实验数据进行定量分析，比较不同样品中目标RNA 分子的大小和相对丰度。
这些数据可以用于进一步研究基因表达水平、转录本差异等生物学问题。
Northern Blot 技术是一种可靠的分子生物学方法，可以用于检测和定量分析样品中特定RNA 分子的表达水平。
该技术需要经过严格的实验操作和数据分析处理，以确保结果的准确性和可靠性。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Northern_blot
Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA（多达10μl）5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
NorthernBlot原理及实验方法
Norther n Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RN A探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：Norther nMax Kit（Cat. # 1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，RandomPrimer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free KlenowFragmen t和10 X Buffer, Sephade x G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RN AZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZa p。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denatur ing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
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Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交
A．探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝
甲酰胺（去离子）
70%乙醇
SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)
用1mol/L HCl调整至pH 7.0
Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)
用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml
于-20℃保存。
预杂交溶液：5× SSC
5× Denhardt 溶液
50%(w/v) 甲酰胺
1%(w/v) SDS
100μg/ml 鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）
杂交溶液：DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液：2×SSC 加入0.1% SDS
0.5×洗膜缓冲液：0.5× SSC加入0.1% SDS
0.1×洗膜缓冲液：0.1× SSC加入0.1% SDS
D. Northern转膜
转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的分子量Marker.
1．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于2×SSC （20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
2．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
3．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。
将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
4．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。
膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
5．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。
切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
6．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
7．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
8．交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时；方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。
带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。
但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。
9．转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。
将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。
可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。
E．杂交
建议杂交条件：探针浓度50~100ng/ml，温度68℃过夜。
1．将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。
2．将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使用)，用预杂交液稀释成设定浓度。
3．将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68℃）杂交过夜。
4．杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于-70℃以备重复使用。
重复使用时，解冻并在68℃下变性10min.。
5．洗膜：杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。
接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42℃，然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68℃。
当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。