WB技术
wb的基本原理和操作流程
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westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。
它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。
最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。
然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。
将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。
掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
免疫印迹wb的原理
免疫印迹wb的原理免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生命科学研究领域。
它可以用来检测特定蛋白质在复杂的混合物中的存在与表达水平，具有高灵敏度和高特异性的优势。
免疫印迹的原理基于蛋白质的分子量、电荷和亲和性等特性。
首先，需要将待分析的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离，将蛋白质按照分子量大小分成不同的带状条带。
然后，将蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常为聚偏氟乙烯膜）上，这个步骤称为电转移。
电转移过程中，蛋白质会被定向转移到膜上，形成与凝胶上相对应的蛋白质条带。
接下来，进行与待检测蛋白质特异性结合的抗体处理。
将膜浸泡在含有特异性一抗的抗体溶液中，一抗与待检测蛋白质结合形成免疫复合物。
为了增强对抗体-蛋白质复合物的检测灵敏度，通常需要进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质。
然后，加入与第一抗体结合的二抗，这个二抗通常是与酶结合的二抗。
这种酶可以与染色底物发生反应，产生明显的信号。
这一步骤被称为二抗结合。
经过洗涤去除未结合的二抗后，加入染色底物，底物与酶发生反应后会生成可见的信号，形成蛋白质检测结果。
这种信号可以通过暗室或者专用的设备进行可视化，并进行定量分析。
免疫印迹技术的优点在于其高度特异性和高灵敏度。
通过使用特异性抗体，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
此外，免疫印迹还可以同时检测多个蛋白质，通过在膜上分别施加不同的抗体可以同时检测多个目标蛋白质。
然而，免疫印迹也存在一些限制。
首先，免疫印迹需要特异性抗体来检测目标蛋白质，这对于一些没有合适抗体的蛋白质来说是一个挑战。
其次，免疫印迹需要较长的实验时间，从样品制备到最终结果的获取需要几天时间。
此外，免疫印迹对于蛋白质分子量较大的蛋白质检测效果较差。
总结起来，免疫印迹是一种常用的蛋白质分析技术，通过将蛋白质从凝胶转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
wb的简化步骤
wb的简化步骤
WB即Western blot，是一种综合性的免疫学检测技术。
其简化步骤如下：
1. 提取膜蛋白或者总蛋白（主要使用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，低温操作）。
2. 制胶（玻璃要洗干净，缓慢铺胶）。
3. 跑电泳（电泳液可以使用干粉直接加双蒸水的，也可以使用SDS、甘氨酸和Tris配制。
上层胶80V+30min，下层胶120V+90min）。
4. 转膜（转膜使用的纤维膜价格较贵，一般分为0.22um、0.47um两种。
小分子蛋白要求孔径小一些，一般300mA+70min，但若发现蛋白在胶上有残留，可适当延长时间）。
5. 封闭（2h BSA或者5%脱脂奶粉，用PBST或TBST配制）。
6. 孵育抗体（4°C过夜，一抗二抗，二抗2h）。
7. 显影（使用ECL）。
WB操作复杂，实验过程中需要严格按照操作步骤进行，同时注意细节和条件的优化，以确保实验结果的准确性。
如果有需要更详细的步骤，可以查询相关的实验手册或者咨询相关的实验技术人员。
wb抗体原理
wb抗体原理
WB（Western Blot）是一种常用的免疫学技术，用于检测蛋白质在复杂混合样品中的表达情况。
WB抗体原理如下：
1. 样品制备：首先，需要将待检测的蛋白质样品经过蛋白质提取和电泳分离的步骤，将蛋白质沿着凝胶中的凝胶孔移动，分离成不同的带状条带。
2. 转移：接下来，将凝胶上的蛋白质条带转移到聚丙烯酰胺薄膜或硝酸纤维素膜上，形成蛋白质的镜像。
3. 阻断：为了防止非特异性结合，将蛋白质镜像放入含有蛋白质（如牛血清白蛋白）的溶液中进行阻断，使膜上所有未特异性结合位点被占据。
4. 抗原结合：将膜和特异性抗体一起孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以识别目标蛋白质的特异性位点。
5. 洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除未结合的抗体。
6. 抗原检测：将与目标蛋白质结合的抗体检测出来。
这通常通过二次抗体进行，该二次抗体与用于包被蛋白质的一抗体结合。
二抗常用的是与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光标记的抗体，可以产生可见的信号。
7. 显色：通过加入特定的底物，使酶催化产生显色或发光信号。
这些信号可以通过X射线或荧光成像系统进行检测和分析。
通过以上步骤，可以确定样本中是否存在目标蛋白质，并评估其表达水平。
WB抗体原理基于抗原-抗体的特异性结合，并通过酶催化等方式展现出来。
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免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制：基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF（200mM的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100ml的modified RIPA buffe：1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH值到7.42. 加10 ml 10%的NP-403. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4* NP-40: 1%* 去氧胆酸钠：0.25%* NaCl: 150 mM* EDTA: 1 mM* PMSF: 1 mM* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml* Na3VO4: 1 mM* NaF: 1 mM三、实验流程为：（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
四、注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。
每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。
当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。
那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。
封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。
封闭很少出状况。
不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。
紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。
抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱，然而历来商品化的抗体质量参差不齐。
各家生产的抗体中质量问题最严重的是scbt的抗体，但它们的价格却是最便宜的。