基因的定位与克隆

RFLP原理示意图
EcoRI
GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAG CATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTC
EcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性
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RFLP是由DNA一级水平的变异造成的。然而，如果DNA变异的位点不 在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来 弥补。 这在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，主要取决于亲 本材料的来源。正常情况下用到6到8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多 态性大不相同。
---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。

特点：直观简单
从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育 等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。
细胞学标记

染色体数目变异及结构变异，表现在染色 体核型（数目、大小、随体、着丝点位置 等）和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发 展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有 限，当染色体数目形态相似时难以分辨。
技术路线：
不同个体DNA的提取
酶切
凝胶电泳分开DNA片段
转膜
Southern杂交
数据分析
RFLP的特点
A B C D 不受环境条件和发育阶段的影响 是共显性的 需要对探针进行标记，还要Southern 杂 交，耗时费力 DNA需要量大，难以用于大规模的育种
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD Random Amplified Polymorphismic DNA
原理
基因组中存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列 由单个短的随机序列引物(~9nt)对基因组进行PCR扩增， 当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件， 就可以产生扩增片段。 ������ RAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位 点间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。
RAPD原理示意图
基因定位的前期条件
• 突变的遗传背景清楚 （单基因，显隐性等……） • 突变物种有高密度遗传图谱（染色体连锁图谱），如需克 隆基因还需物理图谱
– 遗传图谱(genetic map)，即确定基因（或遗传标记）之间的遗传 学距离，用cM(centimorgen)表示
– 物理图谱(physical map)，即确定基因（或遗传标记）之间的绝对 物理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示

获得突变体的方法： 1.1 自发突变 （少，尤其是有重要功能的基因） 1.2 物理、化学诱变 1.3 插入突变法 ：T-DNA 插入法 ；转座子法
突变体
A list of some sequenced eukaryotic genomes
Organism Type
Genome size
119 Mb
SSR原理示意图
GA GA GA GA GA GA GA
A B C
GA GA GA GA GA
GA GA GA GA GA GA GA GA
A
B
C
技术路的侧翼序列 设计特异性引物来扩增SSR序列 经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色 比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在 某个SSR座位上的多态性。
nucleotide polymorphism）。
分子标记的发展 . . .
HiSpeed sequ
CAPACITY
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP AFLPs SSRs
RAPDs
RFLPs
1985
1990
W M
W
M
电泳图
3、简单重复序列标记—SSR （simple sequence Repeats）
或者称为微卫星DNA（microsatellite DNA）

原理：
微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状 简单重复序列，每个重复单元的长度在1—5bp之间，常 见的微卫星如 (TG)n、 (GA)n、(AAT)n或 (GACA)n等， 不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态 性。 SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计 引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列 (Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。
To identify their functions, we can use reverse genetics -knock down/out, or over express the genes.
Forward genetics 正向遗传学
有目的的寻找或创造突变体 突变体遗传背景分析 基因定位克隆
What is a mutation?

突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异， 不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生 化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可 遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。 多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列 的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何 两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一 对有差别，这种差别就是多态性。
PCR DNA
AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增 CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence） CAPS是先扩增，再酶切扩增片段
PCR
与 酶 切 相 结 合 的 方 法
• 作图群体 （F2，RI等）
遗传背景分析：圆粒vs.皱粒
F0 ♀ X ♂
F1
X
F2 5474 2.96 : 1850 1
X2 P
（3：1）=
0.26
= 0.61
遗传图谱
某一物种的遗传图谱（染色体连锁图谱），显示所知的基 因和遗传标记的相对位置。 基因或标记间的距离单位是cM,其遗传图的距离为1厘摩。
基 于 技 术 的 扩 增 方 法
DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site)
基因的定位与克隆
Genomics Era
一段DNA序列
怎样研究基因的功能？
突变体
plants
Reveres genetics ----反向遗传学
•利用一些特殊的手段改变目的基因的正常表达， 看看该基因有什么表现型，从而确定基因的功能。
•反向遗传学的目的性强，需要强大的背景知识， 一些从未研究过的重要基因可能会漏过。
•
能反映生物个体或种群间基因组中某种差异 特征的DNA片段，它直接反映不同个体的基 因组DNA间的差异。
分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各 个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存 在表达与否等问题；
（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创 造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂 合体。
（centimorgan，cM） 交换值(RF)(%)=重组型的配子数/总配子数×100% 1cM = 1 重组值越大，两基因间的距离越远。
一个基本的染色体连锁框架图要求一条染色体上的遗传标 记平均不超过20cM。
玉米高分辨率遗传图谱
大豆A2分子连锁群 （molecular linkage group）
Reveres genetics
In human cell, the immunophilin protein (亲免蛋白) family, which play a role in immunoregulation and basic cellular processes involving protein folding and trafficking. Arabidopsis genome： 52 genes have been found to encode putative immunophilins。
Drosophila 果蝇 165 Mb 13,600 呢？？就需要进行图位克隆（map based melanogaster
到底是哪个基因突变而引起对应性状的改变 cloning）
3.2 Gb
Celera, UC Berkeley, Baylor College of Medicine, 2000 European DGP Human Genome Project Consortium and Celera Genomics Complet e 2006
Number of genes predicted
31,670 (UniProt)
Organization Arabidopsis Genome Initiative
Year of completi on
2000
Arabidopsis thaliana
拟南芥
Oryza sativa Ostreococcus tauri