细胞培养基本技术_(2)PPT幻灯片

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细
胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液
配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培 养基和合成培养基。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 ③箱内留蒸馏水3000毫升于蒸馏水槽中以 保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
常用消毒方法及选择
消毒物品 压力 蒸汽
G0G1
Count
研究细胞动力学、细胞的DNA合成代谢和
有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个周
期来进行，包括：
有丝分裂期（M期）
分裂间期（生长期）：生长前期（G1)、
DNA合成期（S）、生长后期（G2）
0 200
s G2M
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
细胞周期的检测方法
流式细胞仪测定法
贴附生长：
必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体
瘤细胞
悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表
面。见于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮
期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
培养室/工作台
干热 过滤 紫外 化学 化学 线 气体 消毒 剂
＋ ＋＋
电力 抗 辐射 生
素
玻璃制品
＋
＋
＋
金属器械
＋
＋
＋
塑料制品
＋＋ ＋
橡胶制品
＋
＋＋ ＋
培养用液
＋
＋
＋
棉布类
＋
＋
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养板
培养瓶
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
的“生命”。 （３）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。 进化论，遗传学和细胞学说定为现代生物学的三大基
石，而细胞学说又是后二者的"基石"。
细胞培养
从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理 环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下， 使之生存、生长并维持其结构和功能的方法 。
细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养， 缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。 在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都 必须考虑这些。
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜
伏期一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行 实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
机制：接触抑制、密度依赖性
细胞生长状况的观察—细胞周期
M G2
G0
G1
s
DNA Analysis
超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机
驱动空气遁过高效
滤器除去空气中的
尘埃颗粒，使空气
得到净化。净化空
气徐徐通过工作台
面，使工作台内构
成无菌环境。
滤器
高压灭菌锅
不同压力蒸汽所达温度
压力（磅） 5 10 15 20 25 30
温度（度） 108.4 115.2 121.0 126.0 130.4 134.5
细胞是生命活动的基本单位
1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察 软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借 用拉丁文Cella（小室）词。
1838年德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了 “细胞学说”的基本原则。
（１）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的； （２）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
2 细胞的生存环境
温度: 37 ℃
O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
渗透压
3 无污染
4 无毒
实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
器皿消毒
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台：为细胞操作提供无菌环境
紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
培养皿和培养板等表面消毒
细胞培养的基本概念
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分
开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长
的细胞在传代之前称为原代培养。
有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数
量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培
清洁液的配制
2 细胞培养用液的配制
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl
8.0 g
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
KCl
0.2 g
Na2HPO4.H2O
KH2PO4 加水至1000 ml
1.56 g 0.20
消化液：
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞
间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在
10分钟一4小时贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、
胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白
的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有
促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）