高温大曲中细菌总DNA提取方法比较

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酿酒科技 ２００8 年第 10 期（总第 １72 期）·ＬＩＱＵＯＲ－ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００8 Ｎｏ．10(Ｔｏｌ．１72)
高温大曲中细菌总 ＤＮＡ 提取方法比较
张春辉 １，赵树欣 １ ，梁慧珍 ２
（１． 天津科技大学生物工程学院，天津 ３００４５７；２． 天津天士力集团有限公司食品研究所，天津 ３００４１０）
２ 结果与分析
１—方法 １；２—方法 ２； ３—方法 ３； ４—方法 ４ ；５—方法 ５ 图 １ ５ 种方法所得到的 ＤＮＡ 粗提产物电泳图
大曲样品微生物总 ＤＮＡ 提取的目标是获得足够的 量和长度的， 适用于后续分子生物学实验操作的总 ＤＮＡ。 从图 １ 可以看出，除方法 ５（试剂盒法）外，其他 ４ 种方法都能得到一定片段长度的总基因组 ＤＮＡ， 均大 于 ２０ ｋｂ。 采用直接提取方法得到的总基因片段长度略 大于用间接提取方法得到的片段， 这表明各方法对 ＤＮＡ 片断的剪切作用不太明显， 机械破碎间接提取方 法比化学和酶结合的直接方法对大曲总 ＤＮＡ 的剪切作 用稍大；同时也能看出，不同的提取方法对大曲样品总 ＤＮＡ 提取的产率影响较明显。 直接提取法中基于 ＳＤＳ酶的温和裂解法提取产率较高，间接方法中基于玻璃珠 破碎原理的方法得到的 ＤＮＡ 粗产物产率较高。 另外，采 用土壤 ＤＮＡ 提取试剂盒不能得到有效的总 ＤＮＡ，可能 由于大曲中的杂质比土壤中含量多造成的，此方法不适 用于大曲中 ＤＮＡ 的提取。 综上所述，基于 ＳＤＳ-酶裂解 的提取方法获得的 ＤＮＡ 粗提产物在片断大小和相对产 量两方面都较其他 ４ 种方法好，主要是由于直接提取方 法对微生物的损失较少，同时采用温和的化学法和酶裂 解相结合对 ＤＮＡ 的剪切力较小，产生的片段较大。 ２．２ 大曲总 ＤＮＡ 粗提物纯度的比较
大曲是中国固态法白酒特有的糖化发酵剂，含有大 量微生物和酶类。 大曲中所含微生物的种类和数量比例 直接影响白酒的发酵过程，决定着白酒的香型风格。 探 讨大曲中微生物菌系的构成和变化规律对优质白酒的 生产有重要的指导意义。
高温大曲是生产酱香型白酒的糖化发酵剂，虽然前 人已经在高温大曲微生物的分析方面作了大量的研究， 但是以形态学和生理生化指标为基础的细菌检测和分 类方法较为复杂，而且所得出的结论难免与实际情况有 所偏差。 利用传统的实验室分离培养方法，由于环境的 复杂性和培养条件的限制，认为能用现有技术培养的微 生物仅 占 微 生 物 总 种 类 数 的 １ ％左 右［１］，并 且 传 统 的 实 验室分离培养方法不能及时反映出某一生态环境中细 菌的构成和变化规律。 目前，大分子 １６Ｓ ｒＲＮＡ 及其基 因 ｒＤＮＡ 已被作为一个分子指标，广泛地应用于各种微 生物的遗传特征和分子差异的研究［２］。 在基因水平上研 究高温大曲微生物的关键之一是从大曲样品中高效的 获得可进行分子操作的基因组 ＤＮＡ。 由于高温大曲样 品中所含的成分复杂，微生物种类巨大，从中提取出高 质量的微生物总 ＤＮＡ 的难度较大。 随着微生物生态学 的发展， 各种土壤样品中提取 ＤＮＡ 的方法陆续建立起 来， 目前从土壤样品中提取 ＤＮＡ 的方法大体上分为两
Abstract：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ （ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｙｓｉｓ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ） ｏｎ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃ－ ｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｄａｑｕ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＤＳ－ｅｎｚｙｍｅ ｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｂ－ ｔａｉｎｅｄ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２１ｋｂ ｉｎ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７６２，Ａ２６０／Ａ２３０＝１．５８７， ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｕｃｃｅｓｓ－ ｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｍａｋｅ ｉｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｏ ｕｓｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ Ｄａｑｕ ｍｉｃｒｏｂｅｓ． Key words： ｗｉｎｅ； ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｄａｑｕ；ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ；ｂａｃｔｅｒｉａ
①基于机械破碎的总基因组提取方法［４］ （方法 １）
称取 ５ ｇ 大曲于离心管中， 加入 １５ ｍＬ 缓冲液，超
声 ５～１０ ｍｉｎ，离心 ５ ｍｉｎ，收集上清液高速离心 １０ ｍｉｎ，
去除上清液，向沉淀中加入 ５ ｍＬ 提取液。 漩涡混匀，移
到玻 璃 匀 浆 器 中 ，冰 浴 条 件 下 充 分 匀 浆 ，匀 浆 液 １２０００
类［３］：一 类 是 直 接 提 取 法 ， 其 运 用 各 种 物 理 和 化 学 方 法 裂 解土壤样品中的微生物细胞，再抽提总 ＤＮＡ；另一类是 间接提取法，采用差速离心等物理方法将微生物细胞从 样品中分离出来，再用较温和的方法抽提 ＤＮＡ。
本研究以土壤样品中微生物总 ＤＮＡ 的提取方法为 基础，结合高温大曲特有的理化性质，采用不同的方法 提取大曲中的细菌总 ＤＮＡ， 并对不同的方法提取出的 ＤＮＡ 进行综合评价，包括提取片段大小、纯度以及能否 直 接 用 于 １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ 处 理 。 从 而 确 定 有 效 的 总 ＤＮＡ 提取方法， 为在分子生物学水平上研究白酒大曲 微生物资源打好了基础。
收 稿 日 期 ：２００8－07－03 作 者 简 介：张 春 辉 （1982-），男 ，河 北 人 ，硕 士 研 究 生 ，主 要 从 事 工 业 微 生 物 的 研 究 。
张春辉，赵树欣，梁慧珍·高温大曲中细菌总 ＤＮＡ 提取方法比较
பைடு நூலகம்
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１．３ 主要试剂
３ 次平行的提取操作，５ 种提取方法所得到的典型的琼
术操作打好基础，使得利用先进的分子生物学技术对大曲微生物的研究成为可能。
关键词： 白酒； 高温大曲； ＤＮＡ 提取； １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ； 细菌
中 图 分 类 号 ：ＴＳ２６２．３；ＴＳ２６１．１；Ｑ７８
文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－９２８６（２００８）１０－００５４－０３
Comparison of DNA Extraction Methods from High Temperature Daqu
大 曲 ＤＮＡ 提 取 的 目 标 除 获 得 足 够 的 量 和 长 度 的 ＤＮＡ 外，还要尽可能地减少粗提物中的杂质，使后续的 ＰＣＲ 等操作顺利进行。 有研究表明 ， ［９～１０ ］ 环境样品总 ＤＮＡ 粗提物中有机物质主要是腐殖酸和多糖。而大曲相 比较一般的环境样品含有更多的有机物质，这对利用分 子生物学技术对大曲微生物研究的后续操作有很大影 响，因此很有必要把粗提物的纯度做为一项指标来评价 提取方法。 根据大曲样品的特点，选取蛋白质和腐殖酸 污 染 程 度 做 为 ＤＮＡ 的 纯 度 的 主 要 评 价 指 标 。 可 通 过 Ａ２６０／Ａ２８０ 和 Ａ２６０ ／Ａ２３０ 的值来评价。 Ａ２６０ ／Ａ２８０ 是衡量蛋白质 污染程度的指标， 通常在 １．７～１．８ 之间较好；Ａ２６０／Ａ２３０ 是 衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在 １．７～２．０ 之间较好。
②基于玻璃珠破碎的总基因组提取方法（方法 ２） 参见胡佳［５］浓香型白酒大曲细菌 ＤＮＡ 提取方法。 １．４．２ 直接提取方法 ①基于 ＳＤＳ-酶的总基因组提取方法［６］（方法 ３） 取 ５ ｇ 样 品 于 离 心 管 中 ，加 １５ ｍＬ 提 取 液，高 速 漩 涡 混 匀 ，３７ ℃水 浴 ６０ ｍｉｎ，中 间 每 隔 １０～１５ ｍｉｎ 涡 旋 振荡 １ 次；然后加入 ３ ｍＬ １０ ％的 ＳＤＳ（十 二 烷 基 硫 酸 钠），５０ ℃水浴 ２ ｈ，每 １５～２０ ｍｉｎ 缓慢颠倒离心管混匀 １ 次，然后 ６０００ ｒ／ｍｉｎ 室温离心 １０ ｍｉｎ，收集上清液，转 到 ５０ ｍＬ 离心管中。 以下氯仿抽提和异丙醇沉淀步骤同 方法 １。 ②基于冻融裂解的总基因组提取方法（方法 ４） 参见高平平［７］活性污泥 ＤＮＡ 提取方法。 ③试剂盒法（方法 ５） 采用 ＯＭＥＧＡ 公司的 Ｅ．Ｎ．Ｚ．Ｙ． Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ ，具体 步骤按说明书操作。 １．５ 提取效果评价 １．５．１ ＤＮＡ 粗提物片段大小以及产量采用琼脂糖电泳 法检测评价；ＤＮＡ 的纯度主要是 看 蛋 白 质 和 腐 殖 酸 污 染的程度，可通过 Ａ２６０ ／Ａ２８０ 和 Ａ２６０ ／Ａ２３０ 的值来评价；并结 合能否直接用于后续 ＰＣＲ 扩增来综合评价。 １．５．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ 扩增 参照 Ｂｏｓｓｈａｒｄ 等［８］的方法，１６Ｓ ｒＤＮＡ 全长序列 ＰＣＲ 引物为： ２７ｆ 和 １４９２ｒ。 ＰＣＲ 反应体系为：１０～１００ ｎｇ 的 模板，５ μＬ 的 １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２ ），２００ μｍｏｌ／ Ｌ 的 ｄＮＴＰｓ，０．１５ μｍｏｌ／ Ｌ 引 物 ，２．５Ｕ 的 Ｔａｇ 酶 和 适 量 超 纯水（补足 ５０ μＬ）。 ＰＣＲ 反应条件为：９４ ℃变性 ４ ｍｉｎ ， 然 后 在 ９４ ℃ ４５ ｓ ，５０ ℃ ４５ ｓ ，７２ ℃ １．５ ｍｉｎ 循 环 ３０ 次，７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。 １６Ｓ ｒＤＮＡ 全长序列扩增产物用 １．５ ％琼脂糖凝胶电泳检测。
ＰＣＲ 所用试剂（ Ｔａｑ 酶 ，ｄＮＴＰ 等） 为大连宝生物工 脂糖电泳图如图 １ 所示。