高效液相色谱速率理论
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理
1．基本概念
色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)
保留值：保留时间、死时间、调整保留时间
峰宽：标准差、半峰宽、峰宽（色谱峰展宽是指由于柱内外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成柱效降低）
2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程
理论塔板数 n=5.54(tr/wh/2)2
色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高；同样长度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素
范氏方程 h=a b/μ cμ
a为涡流扩散项。
采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散
b为纵向扩散系数。
流动相为液体，柱温为室温，b/μ可忽略不计
c为传质阻抗系数。
在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
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（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
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液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
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液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
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小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
高效液相色谱分类及工作原理
阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
学习液相，必须要知道的三大理论
学习液相，必须要知道的三大理论写在前面高效液相色谱我们常用，如何操作自然难不倒我们，那么，液相色谱的分析的理论基础是什么？这个你知道吗？这一篇咱们好好学一学液相色谱的分析理论基础，可以让你更好地使用高效液相色谱仪。
在说分析的理论基础之前，问大家一个问题，为什么液相色谱柱的内径都不是整数呢？”例如:1.7、1.9、2.1、4.6这是为什么呢？想了解真相？往下看色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相的分配系数决定的，即色谱过程的热力学性质有关。
但是两峰间虽有一定的距离，如果每个峰都很宽，以至彼此重叠，还是不能分开。
这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程中的动力学性质有关。
因此要从动力学和热力学两方面来研究色谱行为。
色谱热力学理论主要研究溶质在色谱柱内的分离机制及分子特征与分离结果之间的关系；色谱动力学主要研究溶质在色谱柱中的运输规律，解释色谱流出曲线的形状、影响色谱区带展宽及峰形的因素，从而为获得高效能色谱分离结果提供理论指导，为峰形预测、重叠峰的定量解析以及选择最佳色谱分离方法奠定理论基础。
先复习一下仪器分析的重点——色谱分析的三大理论。
1相平衡理论相平衡理论认为溶质在流动相和固定相之间达到平衡。
分配（吸附）色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配（吸附-脱附）过程，在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比K分配系数，分配系数是由组分在两相的热力学性质决定的。
在一定温度下，分配系数K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱。
K=Cs/Cm lnK=-△Gm/RTc由上式可以看出分配系数和温度呈反比，升高温度，分配系数变小，组分在固定相的浓度减小，可缩短出峰时间。
分配比κ又称容量因子，它是在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比κ=ms/mm，κ越大说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量越大，因此又称分配容量比或容量因子。
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高效液相色谱速率理论
1956年荷兰学者van Deemter 等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论— 速率理论。
他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。
该理论模型对气相、液相色谱都适用。
式中：u 为流动相的线速度； A ， B ， C 为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数、传质阻力系数。
该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低 H ，从而提高柱效。
1、涡流扩散项A
在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“ 涡 流” 的 流动，故称涡流扩散。
Cu u
B A H ++=
从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，峰形展宽。
A ＝2 λdp
dp：填充物平均颗粒的直径 ;
λ：填充不均匀性因子
展宽程度以A表示
固定相颗粒越小 ( dp↓) ，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。
则由涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。
2、分子扩散项B /u（纵向扩散项）
纵向扩散是由浓度梯度造成的。
组分从柱口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状，如图所示。
它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。
分子扩散项系数为： B=2γD g
B：分子扩散项系数
γ：阻碍因子（扩散阻止系数） , 因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因素 - 弯曲因子
D ：组分在流动相中扩散系数
3、传质阻力项C u
由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。
（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即：
C＝Cg＋Cl
气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。
有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。
这样，使得试样在两相界面上
不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。
对于填充柱，气相传质阻力系数Cg 为：
式中k 为容量因子。
由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。
因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可他Cg 减小，提高柱效。
液相传质阻力系数C1为：
由上式看出，固定相的液膜厚度df 薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。
降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k 值随之变小，又会使C1增大。
当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。
虽然提高柱温可增大Dl ，但会使k 值减小，为了保持适当的Cl 值，应控制适宜的柱温。
g p g d k k C 2
2
2)1(01.0∙+=g p g D d k k C 222)1(01.0∙+=l
f l D d k k C 22)1(32∙+∙=l f l D d k k C 22)1(32∙+∙=
将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程 。
气液色谱速率板高方程 :
这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。
（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C ）包含流动相传质阻力系数（Cm ）和固定相传质系数（Cs ），即：
C ＝Cm ＋Cs
其中Cm 又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即：
式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。
当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀. ωm 是由柱和填充的性质决定的因子。
ωsm 是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。
u D k kd D d k k u D d H l f
g p g p ])1(32)1(01.0[2222222++∙+++=γλm
p sm m p
m m D d D d C 22ωω+=m p sm m p m m D d D d C 22ωω+=
液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs ）可用下式表示：
液液色谱的 Van Deemter 方程式可表达为：
该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。
速率理论的要点
(1) 组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩散 、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到平衡等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。
(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。
(3) 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。
阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；s
f s s D d C 2ω=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωγλ+∙++=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωωγλ+∙++=
柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。