生化——蛋白质分离纯化技术
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
分离纯化的前期步骤
29
（二）有机溶剂提取法
❖ 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链 较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀 酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶 剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂 性、是理想的提脂蛋白的提取液。
内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来； ❖ 另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。 ❖ 硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，
需用硫酸或氨水调节。
41
42
43
44
影响因素
❖ 温度: ❖ 除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，
一般可在室温中进行。 ❖ 一般温度低蛋白质溶介度降低。 ❖ 但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋
❖ 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对 其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。
17
18
（6）细胞自溶法
❖ 利用细胞自身的酶
19
(7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提）
❖ 丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合 物，从而使细胞膜的结构破坏。
❖ 一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。
20
(8)酶处理方法
❖ 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当 方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开 来。
❖ 一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机 溶剂分级分离等方法。
6
❖ 第三步是细分级(fine fractionation)，也就是样 品的进一步提纯。
❖ 样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大 部分已被除去。
12
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
生化
1、根据蛋白质的理化性质，详细阐述蛋白质分离提纯的主要方法。
答蛋白质分离纯化时常根据一下理化性质选择分离方法（一）根据分子大小不同的分离方法（1）透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，时蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
常用的半透膜时玻璃纸，火棉纸和其他合成材料（2）密度梯度离心蛋白质颗粒的沉降不仅决定于他的大小而且也决定于他的密度。
常用的密度为蔗糖梯度。
蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与本身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带（3）凝胶过滤凝胶珠是多空的网状结构，凝胶的交联度或孔度决定了凝胶的分级范围。
与不同分子大小的蛋白质混合流经凝胶层析柱时，由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子先被洗脱出来。
（二）根据蛋白质溶解度不同的方法分离（1）盐析利用不同蛋白质在不同盐浓度中溶解度的差别，分离纯化某种特定的蛋白质。
用于盐析的中性盐以(NH4)SO4最常用，其溶解度大，且不伤害蛋白质。
另外常用的盐还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等（2）等电点沉淀蛋白质在等点状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小故可利用这一性质对pr惊醒分离。
等电点沉淀操作的条件是低离子强度：Ph约等于PI，且通过加入无机酸调节PH值。
一般适用于疏水性较大的Pr（3）低温有机溶剂沉淀加入与水可以混容的中性有机溶剂，特别是甲醇、乙醇、丙酮、可降低多数PR的溶解度并使之沉淀（三）根据蛋白质带电性（1）电泳由于各种蛋白质在同一PH条件下因分子量及电荷量不同使其电泳迁移率不同。
新近发展的等电聚焦区带电泳是利用一种两性电解质做载体放入电解槽中，通以直流电,两性电解质即形成一个由正极到负极的逐渐增加是PH梯度。
与把蛋白质样品加入时，带正电的蛋白质向负极移动，带负电的蛋白质向正极移动，直至达到其等电点PH的位置。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理
蛋白质纯化是生物分子的一项重要技术，它是分子生物学的核心技术之一，也是蛋白质结构及功能的研究的基础。
它可以从生物样本中分离出蛋白质，研究其结构、性质、功能及相关特性。
根据蛋白质纯化的原理和方法，可以分为物理法、化学法和生物学法等。
1.物理法
物理法是纯化蛋白的最简单方法之一，通常通过使用力场或温度去把一定浓度的蛋白质从溶质中萃取出来。
物理法不耗费能量也不会改变蛋白质的化学结构，不改变蛋白质的结构和功能，但有时可能会引发蛋白质的活性降低，因为櫛发性和相互之间复合物的结合可能会受到改变。
例如分子筛膜技术、沉淀离心技术等。
2.化学法
化学法是一种可以改变蛋白质结构的方法，一般是通过有机溶剂或水溶性固定相，以水或有机溶剂和化学试剂实现蛋白质的分离和纯化。
化学法可以破坏蛋白质的活性，从而改变其化学结构和功能，或者通过改变蛋白质的电性或物理状态来实现蛋白质的分离和纯化。
例如偏光技术、电泳技术、蛋白质酶剪切技术等。
3.生物学法
生物学法是一种比较复杂的蛋白质分离方法，是利用特定生物因子。
生化大实验实验报告范文
生化大实验实验报告范文一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配某10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02MTri-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配某10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephade某G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephade某G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
上某种电荷基团形成的。
-+
+
高分子聚合物基质
-+
-
电荷基团
平衡离子
(2) 凝胶过滤（gel filtration chromatography）
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小 进行分离的技术，又称之凝胶过滤、 分子筛层析或排阻层析
Gel filtration. This method separates proteins according to size.
目前几种测定蛋白质结构的方法 1、同源建模 被认为是目前最精确的方法 2、折叠识别 通过预测二级结构、预测折叠 方式和参考其他蛋白质的空间结构，从而产 生目标序列的三维结构 3、从无到有 根据单个氨基酸形成二级结构 的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产 生目标序列的三维结构
谢谢大家 黄嵩
异，柱介质是结合着带电基团的合成聚合物。
结合着阴离子的称为阳离子交换树脂(cation
exchanger), 结合阳离子的称为阴离子交换树
脂(anion exchanger)。
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂 的结合力不同而进行分离纯化的。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于 水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合
使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原
剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋
白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟）， 通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基 的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂 可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还 原）
2) 等电聚焦（isoelectric focusing）
二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀法
丙酮沉淀：在0~4℃时，用10倍于蛋白质溶 液体积的丙酮加入到蛋白质溶液中，形成 沉淀后，立即分离，防止蛋白质变性 盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子 沉淀析出的过程称为“盐析”，它属于沉 淀法，目的是将所需要的蛋白质转入固相 沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分 离 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应抗原 蛋白质，以形成复合物从而分离蛋白质
蛋白质的分离、纯化和结构分 析
2401120102 黄嵩
蛋白质分离指利用其理化性质，
采取透析、盐析、电泳、层析以 及超速离心等不损伤蛋白质空间 构象的物理方法，以满足研究蛋 白质结构域功能的需要
一、透析和超滤法可除去蛋白质溶液中的小分 子化合物
利用透析袋分离蛋白质的方法叫透析发，透析袋是 具有超小微孔的膜，一般只允许分子量为10kD以下 的化合物通过，高分子蛋白则留在袋内
七、应用物理学、生物信息学原理测 定蛋白质空间结构
通常采用圆二色光谱(circular dichroism,CD)测定溶液状态下的蛋白质二 级结构含量 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振 技术(nuclear magnetic resonance,NMR)研 究蛋白质三维空间结构 近年建立起来的二维核磁共振技术也已用于 测定蛋白质三维结构
三、利用电泳法分离蛋白质
电泳（electrophoresis）
在外电场作用下，带电蛋白质将向与其电性相反的电
极移动的现象
一般不用于纯化大量蛋白 质，常作为一种分析手段
1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），它以聚丙烯酰胺凝胶作为支 持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲 叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由 基催化完成。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量：
利用聚丙烯酰胺凝胶内
的缓冲液在电场作用下在 凝胶内沿电场方向制造一 个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至 与它的pI 相一致的pH处。
Isoelectric focusing. This technique separates proteins according to their isoelectric points.
沉降系数：生物度为沉降系数（s）。单位用S，即Svedberg单位，
为1×10-13秒。
dx / dt mp(1 v ) s 2 x f
（mp：颗粒质量；v ：偏微比容；：溶剂密度；f：摩擦系数） S与颗粒的质量和密度、溶剂的密度和粘度有关，可根据沉降 系数的不同来分离和检定生物大分子、亚细胞器和微生物。
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 柱床体积为Vt 外水体积为Vo 内水体积为Vi 基质体积为Vg， 则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以 忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi
五、超速离心分离
超速离心法即可以用来分离纯化蛋白质也可 以用来测定蛋白质的分子量 蛋白质在高达50万g(g为gravity)的重力作用 下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力等于离 心力时，沉降停止 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示
四、相分配或亲和原理分离蛋白质
层析技术，亦称色谱技术，是利用混合物
中各组分的物理、化学、生物性质的差 别，使各组分以不同程度分布在两个相 中（其中一个相为固定的，称为固定相； 另一个相则流过此固定相，称为流动相） 并使各组分以不同速率随流动相移动， 从而达到分离各组分的效果。
(1) 离子交换层析（ion-exchange chromatography) 利用一定pH下不同蛋白质带电种类和电量的差
六、应用化学或反向遗传法分析多肽 链氨基酸序列
第一步：分析蛋白质的氨基酸残基 第二步：测定多肽链的氨基末端和羧基末端 的氨基酸种类 第三步：将肽链水解成片断，分别进行分析， 然后测定各肽段的氨基酸排序，一般采用 Edman降解法 第四步：整合对比，得出肽链氨基酸排序 近年来也可以通过核酸来推演氨基酸排序