细胞爬片制作
细胞爬片实验方案
准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS 4%多聚甲醛溶液:多聚甲酵40g O.lmol/L 磷酸缓冲液至1000 mL方法:称収40g 多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液, 加热持续搜拌( 或磁力搅拌) 使粉末完令溶解, 通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L 的PBS至1000 mL,充分混匀。
0.1 M (pH 7.4) PBS1 mol/L Na2HP0477.4ml1 mol/L NaH2P0422.6ml蒸馏水加至10001 爬片的准备爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片, 根据自己的需要剪裁成合适的大小, 以备置于6孔板、1 2孔板或24孔板; 将剪裁好的爬片, 泡酸过夜, 捞出后流水洗净, 烤干浸泡于75%酒精中备用2 细胞爬片用胰酶消化好细胞, 充分吹打, 使之成细胞悬液, 计数, 根据需要调整细胞到适当密度。
取无菌的细胞培养板, 先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触) 。
将玻片小心从洒精中取出, 在酒精灯火焰外焰轻轻划过, 使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。
待冷却后, 将玻片轻轻放入培养板中, 然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。
然后置于37°C 5%C02 的细胞培养箱屮培养。
培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养( 2ml, 100卩g ml-1 in DMEM ) 6h后，用PBS 冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。
对于贴壁能力较弱的细胞, 爬片前应将玻片置于细胞培养板中, 用PLL 包被至少Ih 。
3 细胞固定爬片置于37 ° C PBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15 分钟, 然后再用37° C PBS 将多聚甲醛冲干净, 清洗过程要注意手法轻柔, 否则细胞会从玻片上脱落。
固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干, 然后用50% 的甘油PBS溶液封片,备用。
细胞爬片制作
如果是细胞块，就更简单了，就是培养一段时间，消化收集细胞，离心成细胞团块在离心管底，大约绿豆大小，接下来和组织标本一样常规固定、脱水包埋、切片染色。
【爬片的准备】1. 爬片：24*24盖玻片，刚好用于6孔板。
也可用更大的盖玻片，放在大的培养皿中爬片。
2. 盖玻片泡酸过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒、烤干。
3．我做的时候嫌处理麻烦，都是新拆封一盒新的盖玻片，直接浸泡75%乙醇10分钟消毒，然后酒精灯上烤干，直接放入培养皿，开始种细胞。
重点是玻片是干净的、无菌的。
4.盖玻片在液体中经常有贴壁吸附力，用一般镊子很难一次性夹起，我是将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以。
4. 小连她们似乎曾经用过载玻片进行爬片，优点是玻片厚而大，后期操作拿取方便，不容易破碎。
具体步骤不清，你可以打电话问问。
【细胞爬片】1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
注意细胞不能太密，否则容易掉片。
【细胞爬片的固定】1. 细胞爬片取出后，PBS洗2遍。
但比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
2.常用的固定液，我选的是第三种。
1. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。
细胞爬片
一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。
两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。
然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。
第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。
这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。
用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。
第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。
漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。
第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。
目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。
可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。
第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。
细胞生物学实验-细胞爬片
二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试 剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品： 盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、 试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、 废液缸。
细胞传代（II） -------细胞爬片
2018.10.19
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在 玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片， 细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也 可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时， 要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高 压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上 的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成 细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培 养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及 操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课 期间换液即可。
9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养 皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉 或吸出培养基。细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。
细胞爬片步骤
细胞爬片步骤PLL配制和处理（Sigma产品，武汉博士德分装，10ml/瓶。
4℃存放，有效期1年）(1) 储存液：1:10稀释液可以保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。
稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。
工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液枪吸取0.3ml PLL＋3ml无菌去离子水，混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。
封口模密封后4℃存放。
(2) 无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4℃保存。
另外，准备无菌去离子水50ml。
多聚赖氨酸PLL包被（1）灭菌的去离子水(三蒸水)1:10稀释多聚赖氨酸溶液。
（2）用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度维持在18-26℃。
（3）将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。
（注意增加时间不会提高包被效果）。
（4）将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作)，然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡5min，无菌晾干即可。
（底面贴紧培养皿，存在包被PLL不好的可能，放入培养板孔内注意正反面！！）或者：铺片于培养皿中，移液枪将PLL 工作液滴加于玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。
在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。
或者：在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。
步骤：（1）准备24孔细胞培养板（消毒好的培养皿）（2）多聚赖氨酸PLL包被（3）培养板每孔中滴1滴培养基，然后将玻片置于液滴上，压紧（通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上）（4）常规细胞消化，离心，重悬，将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上，让其贴壁生长，可以用移液枪加样30μl于盖玻片上（5）24孔板做完细胞爬片后，再小心用镊子将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片，照相。
（主张用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”）（6）PBS洗涤，以去除血清等物质。
细胞爬片制备详细过程
【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。
如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。
烤干后可放入超净台中。
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
末取出的可接着继续培养。
【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。
当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
细胞爬片制备详细过程.doc
【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。
如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。
烤干后可放入超净台中。
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
末取出的可接着继续培养。
【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。
当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
细胞爬片步骤与方法
细胞爬片是细胞培养中比较经常会用到的，现将自己操作的一些方法与技巧拿与大家分享，如有不当的地方还望大家给与指正：【爬片的准备】1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是冲洗干净就可以了），放在饭盒或者培养皿（一定是玻璃的哦，要不然就……）中烘干后进行高压消毒。
【培养板的准备】1、泡酸过夜2、冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）3、放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。
贴壁能力强的话，就可以省略了，进行紫外线消毒）注：此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。
目的：浸过PBS 的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，以利于细胞长到爬片上。
（自己刚开始做的时候，经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间，爬片上细胞罕见。
）【细胞爬片】1、胰酶消化细胞后计数2、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可3、第二天即可进行干预措施用甲醇:丙酮=1:1新鲜配置固定,适用于一切培养细胞,效果不错!不需要预冷,固定时间大概要10分钟,各种细胞均适用.用PBS溶解（使用前用盐酸和碳酸氢钠调节ph值为7.2（PH值不影响溶解性））一般浓度都是5mg/ml。
我用磁力搅拌器搅拌溶解的，千万不要加热。
搅拌时，烧杯上面要套上一个遮光的袋子（我用袋装牛奶袋），不到10分钟，见完全溶解。
尽快用0.22um 的微孔滤膜过滤。
分装至已经高压过ependoff管中，每管1.0ml.（－20度保存），余下一部分4度保存，两周内使用。
我做了好多次，发现没有问题。
祝好运！。
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细胞爬片全过程经验总结
细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。
Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。
【爬片的准备】
1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；
2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24
孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。
如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无
水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。
烤干后可放入超净台中。
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
但我在做爬片
时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
【细胞爬片】
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使
玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力
较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
末取出的可接着继续培养。
【细胞爬片的固定】
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。
当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。
然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。
一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
以下为常用的固定液
1.冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。
取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
3.95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
4.甲醛(福尔马林)应用最广
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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