突变体鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
突变体鉴定技术在植物育种中的应用
突变体鉴定技术在植物育种中的应用一、突变体鉴定技术概述突变体鉴定技术是指利用基因突变或染色体突变等突变现象，在生物体的基因组或染色体组中寻找变异体，并对其进行鉴定和评价的技术。
突变体鉴定技术在植物育种中的应用相对来说较为广泛，主要有随机突变体筛选、化学、物理诱变体筛选、转座子插入突变体筛选、RNAi抑制体筛选等。
二、随机突变体筛选技术随机突变体筛选技术是一种利用不同筛选策略来寻找植物新突变体的技术。
该技术主要包括自然突变体分离、EMS诱导突变体筛选、紫花苜蓿随机突变体筛选以及T-DNA插入突变体筛选等。
1. 自然突变体分离：自然突变体分离的原则是利用悬垂小球法获取悬浮球培养物，然后在培养物中筛选出不同的突变体。
自然突变体分离通常需要耗费一定的时间和人力成本，在实际应用中不太常用。
2. EMS诱导突变体筛选：EMS（乙基甲磺酸）是一种化学诱变剂，可以引起基因的点突变和染色体的断裂重组等现象。
EMS诱导突变体筛选的原理是将EMS作用于植物组织中，再根据所需特性筛选出目标突变体。
这种方法可以较为快速地诱导出培养物中的突变体，被广泛用于获得与生物体形态、生长等方面有关突变体的筛选。
3. 紫花苜蓿随机突变体筛选：紫花苜蓿随机突变体筛选主要是利用基于DNA甲基化的遗传活性指数技术，来评估苜蓿中的DNA甲基化水平差异所诱导的突变体。
该方法目前主要用于识别与生物体对环境胁迫或致病因素的响应相关的突变体。
4. T-DNA插入突变体筛选：T-DNA插入突变体筛选主要是通过构建T-DNA插入文库，将T-DNA插入到目标基因流区域，然后通过PCR扫描或其他遗传操作方法，鉴定得到的突变体，并进行筛选。
三、化学、物理诱变技术化学、物理诱变技术是指利用化学剂或物理因素对生物体进行诱变，产生一定比例的突变体，并对其进行筛选。
1. 化学诱变技术：化学诱变技术主要是利用一些化学剂，如硫酸亚铁等在处理过程中对目标植物进行诱变。
该方法操作简单，结果稳定可靠。
突变体筛选与鉴定方法
突变体筛选与鉴定方法近年来，基因编辑技术的发展使得我们能够更加准确地对生物进行基因改造和操作。
而基因编辑的核心工具——CRISPR/Cas9系统，也成为目前最受欢迎的基因编辑技术之一。
但是，伴随着CRISPR/Cas9系统的应用越来越广泛，也带来了突变体筛选与鉴定方法的挑战。
在这篇文章中，我们将介绍突变体的鉴定方法，探讨如何准确地筛选出想要的突变体。
一、突变体筛选的背景突变体筛选是在进行基因编辑后，判断目标基因是否得到改变，验证是否成功。
突变体最直接的改变是单核苷酸多态性（SNP），也就是一种点突变。
此外，还有DNA脱失、插入、替换等多种突变体现象。
然而，由于CRISPR/Cas9系统的特殊性质，突变体筛选方法也有所不同。
相对于传统的突变体筛选方法，CRISPR/Cas9系统可以在细胞中直接用“选育”方式来筛选突变体。
这意味着，只有在目标基因的两端都进行了编辑后，才会得到突变体。
因此，在突变体筛选中，需要一个敏感而具体的方法来判断编辑效果。
二、常见的突变体筛选方法1.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种快速而常见的DNA扩增技术，也被广泛地应用在突变体筛选中。
PCR可以扩增目标DNA序列，同时提供更多DNA模板来进行下一步的筛选。
PCR筛选通常需要根据目标基因的DNA序列设计引物并扩增目标DNA区域。
这样，分子生物学家就可以快速获得所需的更多模板，在下一步中用于DNA测序和鉴别。
2. T7E1酶切T7E1酶切是基于遇到不匹配DNA（也就是突变！）时，酶会将不匹配的DNA切成两段。
在CRISPR/Cas9系统中，T7E1酶可以用于分析基因组的不匹配区域，并通过Gel切胶和测序鉴定SNP的存在。
3.限制性片段长度多态性（RFLP）RFLP是利用遗传变异在各个基因组区域间的差别，通过酶切不同碱基产生的限制酶切位点差异，从而实现区分人群，确定DNA指纹或植物品种鉴定信息的方法。
这种筛选方法需要在基因组中筛选适合的酶切位点，并使用RFLP分析盒进行限定性酶切，以确定序列到位。
突变体的筛选和评价方法
突变体的筛选和评价方法突变是基因组的一种常见现象，突变可以是自然发生的，也可以是由环境因素引起的。
突变可以导致基因组的结构和功能出现重大变化，从而影响生物个体的生存和繁殖。
突变体的筛选和评价是生物学研究中非常重要的步骤。
下面将从基本概念、筛选方法和评价方法三个方面进行讨论。
一、基本概念所谓突变体，是指基因或染色体在自然环境或人工处理下出现的一种或多种变化。
突变体通常与野生型相比，表现出一些新的性状，包括代谢、生长、发育、生殖等方面的改变。
这些变化可以用于生物育种、污染监测、环境毒性评价、分子修饰等领域。
突变体的筛选和评价通常涉及到以下几个方面的问题：1. 筛选出突变体：如何选择或设计合适的筛选条件，从复杂的基因组变异现象中筛选出有意义的变异类型。
2. 突变体的鉴定与分类：如何根据遗传特征、分子结构等特点，对筛选出来的突变体进行鉴定和分类。
3. 突变体的功能评价：如何通过基因表达、代谢代谢产物、生理生化指标等方面的测定，评价突变体在生物学各方面的功能变化，从而为应用提供理论依据。
二、筛选方法突变体的筛选通常是通过人工设计或自然筛选的方式来实现的。
下面介绍几种常用的筛选方法：1. 微生物筛选微生物筛选是目前最常用的筛选方法之一。
其中最常用的方法是在培养基中添加突变源和需要鉴定的物质，筛选出突变株生长或代谢性能改善的菌株。
利用此法，已经筛选出了许多能够高效生产酶、生物柴油等物质的菌株。
2. 生长筛选生长筛选方法是将突变株和野生型放在同一环境中，通过比较生长速度、形态、生理特征等指标来鉴定和筛选突变株。
生长筛选方法最常用于植物和细胞的研究中。
3. 身体表型筛选身体表型筛选是指通过比较突变体和野生型在形态、生理、生化代谢等方面的差异，来鉴定和筛选突变体。
例如，通过对荔枝果实表型特征的比较，可以鉴定出野生型与浅色肉品种间对比浓色肉品种等突变体。
三、评价方法突变体的评价方法通常包括以下几个方面的内容：1. 分子鉴定方法分子鉴定方法是目前最常用的方法之一。
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析
水稻卷叶半不育突变体的鉴定及初步遗传分析水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它是全球人类的主要粮食来源之一。
水稻卷叶半不育突变体是一种常见的水稻不育突变体，其对水稻产量和品质有着严重的影响。
对水稻卷叶半不育突变体进行鉴定和遗传分析，对于水稻产量和品质改良具有重要的意义。
（一）形态特征鉴定水稻卷叶半不育突变体的表型特征主要表现为水稻叶片呈现卷曲、卷缩的现象，严重影响叶片的光合作用和养分吸收。
水稻卷叶半不育突变体的花药发育也呈现异常，花药小而褐色，且不育率较高。
通过对不同的品种和材料进行相关的形态特征观察和比较分析，可以初步确定水稻卷叶半不育突变体的鉴定。
（二）生理生化特征鉴定水稻卷叶半不育突变体的生理生化特征是其的重要鉴定信息。
通过对水稻叶片和花药中相关生理指标的测定，比如叶绿素含量、光合速率、氧化还原酶活性等，可以对水稻卷叶半不育突变体进行生理生化特征的鉴定。
（三）遗传分析鉴定对水稻卷叶半不育突变体进行遗传分析是其鉴定的重要手段。
通过对不育系和育性系进行杂交，结合对F1和F2代的观察和分析，可以初步确定水稻卷叶半不育突变体的遗传模式和遗传规律。
（一）遗传分析实验设计1. 选择不同的水稻品种和材料，包括卷叶半不育突变体、不育系和育性系等。
2. 进行不同品种和材料之间的杂交，并培育F1和F2代。
3. 对F1和F2代进行相关形态特征和生理生化特征的观察和分析。
（二）结果分析通过对F1和F2代的观察和分析，可以得到以下初步的遗传规律：1. 水稻卷叶半不育突变体的不育性状具有显性遗传特点，F1代均表现为不育型。
2. F2代中出现了不育型和育性型的个体，且不育型和育性型的比例约为3:1，符合孟德尔遗传定律。
（三）初步讨论通过初步的遗传分析，可以得知水稻卷叶半不育突变体的不育性状表现为半显性遗传，且其遗传规律符合孟德尔遗传定律。
这为今后进一步深入研究水稻卷叶半不育突变体的遗传特点和遗传机制提供了重要的基础数据。
突变体鉴定
作物突变体的细胞学研究一、突变体的初步观察和遗传分析在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F1世代；将得到的F1自交得到各个的F2世代；将F1与M进行回交，分别得到对应的BC1世代；如果需要，还可以继续回交得BC2等世代。
观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状；分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制；结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F1突变性状，可判别突变性状为隐性或显性；统计分析F2和BC1世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。
在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。
二、突变体的细胞学观察核型分析原理与步骤核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。
结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。
在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。
染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。
染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。
染色体数目以该植物的体细胞为准，计数30个以上染色体分散良好的细胞，85%以上的细胞中染色体数目稳定在一个数目上，则这个数就是该植物的染色体数。
染色体形态作为核型分析的染色体,一般以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态。
突变体分析与基因功能鉴定
突变体分析与基因功能鉴定突变体是指在基因组中发生的突变或变异的个体或细胞。
突变体的出现为科学家们研究基因的功能和生物体发育提供了重要的手段。
本文将介绍突变体分析的方法以及基因功能鉴定的流程和技术。
一、突变体分析的方法1. Random Mutagenesis（随机突变）随机突变是最常用的突变体分析方法之一。
它通过对生物体或细胞进行物理、化学或遗传学上的处理，引起DNA序列上的突变。
其中，化学诱变剂如EMS（乙酰甲基亚砜）或物理诱变剂如辐射等被广泛应用于随机突变的实验中。
通过这些处理，科学家能够获得大量具有不同突变类型的个体或细胞。
2. Site-directed Mutagenesis（定点突变）定点突变是通过特定的实验操作，对DNA序列中的一个或多个碱基进行有针对性的修改，从而引起特定的突变。
这种方法通常需要设计合成突变的引物，在PCR扩增的过程中使其与目标DNA序列杂交，形成突变的DNA产物。
定点突变方法广泛应用于特定基因功能区域的突变体建立以及功能研究中。
二、基因功能鉴定的流程基因功能鉴定是通过分析突变体的表型差异，推断出突变基因的功能。
下面是一般的基因功能鉴定流程：1. 突变体筛选在突变体库中，利用表型上的明显特征差异进行筛选，如落后生长，器官畸形等。
这能够帮助科学家排除表型未发生变化的个体，有针对性地选择突变体。
2. 遗传定位通过突变体的遗传追溯和染色体位点预测，确定突变位点所在的基因区域。
常用的方法有相关性分析、连锁分析和SNP标记等。
3. 候选基因鉴定综合利用遗传定位和基因组学信息，筛选出突变体可能的候选基因。
并通过进一步的功能分析，最终确定可能的作用基因。
4. 功能验证利用分子生物学、细胞生物学、生物化学等方法对候选基因进行功能验证。
例如，通过基因敲除、基因表达或突变恢复实验证明特定基因对突变体表型的影响。
三、基因功能鉴定的技术1. CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，通过设计合成特定的CRISPR引导RNA和Cas9蛋白靶向修饰基因组。
突变体筛选与功能鉴定
突变体筛选与功能鉴定随着科学技术的不断发展，突变体筛选与功能鉴定成为生物学领域中的重要研究方向之一。
突变体是指在生物体基因组中发生突变或变异的个体，通过筛选与鉴定这些突变体，我们可以深入研究基因功能和生物体的遗传特性。
一、突变体筛选方法突变体筛选主要有两种常用方法：自然突变体筛选和人工突变体筛选。
1. 自然突变体筛选自然突变体是在自然界中诞生的突变体，它们不是由人为诱导的突变。
自然突变体筛选方法主要包括观察、筛选和定位。
观察：通过对大量生物体进行观察，发现具有特定性状变化的个体。
筛选：根据特定性状进行筛选，从大量个体中挑选出表现突变性状的个体。
定位：确定突变基因的位置，找出突变体在基因组中的具体位置，并进行基因测序。
2. 人工突变体筛选人工突变体是通过人为手段诱导的突变，常用的诱导方法包括化学诱变剂和突变基因工具。
化学诱变剂：通过给生物体暴露在化学物质中，使生物体的DNA 发生突变。
常用的化学诱变剂包括EMS（剧毒亚硝酸甲酯）和ENU （乙基甲烷磺酸酯）等。
突变基因工具：利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，通过设计特定的引物和酶切酶，引导Cas9蛋白靶向性地编辑目标基因，导致基因发生突变。
二、突变体功能鉴定突变体筛选后，对于突变基因的功能进行鉴定是非常重要的。
常用的突变体功能鉴定方法主要有：1. 表型分析通过观察突变体在形态结构、生理生化等方面的差异，来分析突变体的表型变化，进而推测突变基因的功能。
2. 基因表达分析通过比较野生型和突变体基因的表达差异，来研究突变基因在转录水平上的功能变化。
常用的基因表达分析方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
3. 蛋白质互作分析突变体功能鉴定还可以采用蛋白质互作分析的方法，来研究突变基因在蛋白质水平上的功能。
常用的蛋白质互作分析方法包括酵母双杂交法、质谱分析等。
4. 代谢途径鉴定通过分析突变体代谢物的变化，来研究突变基因在代谢途径上的功能。
常用的代谢途径鉴定方法包括代谢物分析、代谢组学等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
④ 4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑤取上清至新的EP管中，加300 µl 三氯甲烷， 用手轻轻震荡20s。 ⑥4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑦取上清至新的EP管中，加250µl异丙醇，混 匀，冰上20分钟。 ⑧4℃，12000rpm离心8分钟。
弃 上 清 ， 加 6 0 0 µl 7 5 % 的 乙 醇 ， 4℃ ， 12000rpm离心8分钟。 室温下干燥（一般干燥5—10分钟）后，加
（1）以所提的突变体和野生型植株的DNA为模板，以F、 R、LBb1为引物两两配对成3对引物对，进行PCR扩 增，20 µl反应体系如下： 10×Buffer 2 µl dNTP 0.4µl 引物 0.4µl 模板 1µl Taq 酶 0.2µl 蒸馏水 16µl （2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。将PCR产物 中加入loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，成像。 （3）根据电泳条带的分布与数目，初步判断突变体的 纯杂性
2.PCR鉴定突变体纯合体、杂合体
批注：＋表示有条带，－无条带
结果与分析
• 根据PCR鉴定凝胶电泳的成像图，分析材 料中突变体植株的纯、杂合性。
实验原理
• T-DNA插入到植物染色体上的什么位置以及 怎样插入都是随机的。外源DNA插入到目的 基因后，引起该目的基因的核苷酸组成成 分发生变化。三引物法PCR（F、R、LBb1) 鉴定突变体植株的T-DNA整合的纯、杂合性。
• 材料和试剂
野生型拟南芥、T -DNA插入突变体植株。 液氮、 无水乙醇、 酚氯仿溶液、三氯甲A突变体的鉴定
T-DNA突变体的鉴定 T-DNA突变体的鉴定
• 实验目的 • 实验目的 1、了解植物DNA的提
1、了解植物DNA的提取。 取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合 2、掌握T-DNA插入突 体的鉴定方法。 变体中纯合体、杂合
体的鉴定方法。
实验原理
• Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上 有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物 细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞, 并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一 段能转移的DNA被叫做T-DNA。
内容
1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 2.PCR鉴定突变体纯合性、杂合性
1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 ①取拟南芥植株一个放于1.5mLEP管中，迅 速放入液氮中1分钟后，研磨至粉末状。
②加入250 µl extraction buffer液，混匀， 在37℃水浴锅中水浴5—10分钟。 ③加入550µl的酚氯仿溶液（加下层），混 匀，轻轻震荡20s,置于冰上1—2分钟。