发酵调控学完整版
发酵调控PPT课件
三、产物降解酶缺失突变株
为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后，如图所示：
四、增加前体物的合成
通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。
（一）选育抗代谢类似物的突变株（Analogue Resistance Mutant）
通常微生物生长需要各种代谢物。如维生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢终产物如氨基酸A过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白质中去。只有当氨基酸A 浓度足够高时，A与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞中的A参与蛋白质合成，而使细胞中A的浓度下降到一定程度时，A就会从调节酶的调节部位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调节，又重新可以合成新的A。当A的浓度再次上升到一定值时，反馈调节再次发生…….。
(二)高产r-亚麻酸 菌株的选育思路
图3-9 高产r-亚麻酸 菌株的选育思路
1、出发菌株 多采用被孢霉（Mortierella）毛霉（Mucor）红酵母（Rhodotorula）小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂高的真菌作出发菌株。
2、切断或减弱支路代 a-亚麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸- 花生四烯酸L、二十碳五烯酸L
《发酵调控学》课程教学大纲
《发酵调控学》课程简介发酵调控的主要目标是识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力，或对细胞性质进行总体改性。
本课程以工业发酵过程的调控为主线，运用微生物的生理生化和分子生物学知识阐述微生物的代谢调节与发酵规律，对微生物生长、细胞代谢、代谢途径的调控、次级代谢合成以及代谢工程与途径工程等都做了深入的阐述，对发酵过程参数检测与在线监控也做了较全面的介绍。
Brief IntroductionThe objective of fermentation regulation is to improve the yield of fermentation product. This courses aims at providing students with a detailed knowledge of both theoretical and practical aspects of fermentation regulation. The main content include niicroorganisuin growth, cell metabolism, primary and secondary, metabolic regulation, metabolic engineering. In addition, the parameter inspection and control for fermentation process will be covered.《发酵调控学》课程教学大纲第一章微生物的生长与调节1. 1微生物的生长1. 1. 1微生物的个体生长与群体生长1. 1. 2微生物生长的测定1. 1. 2影响微生物生长的因素1. 2微生物的生长速率I. 2. 1概念1. 2. 2 Monod 方程1. 3微生物生长调节地学重占、难占微生物质生长而节理论与技术第二章细胞代谢综述2. 1细胞代谢概述2. 2运输过程2. 3供能反响2. 4生物合成反响2. 5聚合反响2. 6生长能学教学重点、难点微生物细胞的代谢第三章代谢途径的调控3. 1代谢调节的方式3. 2酶活性的调控3. 2. 1激活3. 2. 2抑制3. 2. 3酶活性调节的机制3. 3酶浓度调节3. 3. 1酶合成的诱导3. 3. 2酶合成的阻遏3. 3. 3分解代谢物阻遏3. 3. 4酶合成机理操纵子学说3. 4诱导、阻遏作用的克服3. 5总体调控：在完整细胞水平上的调控3. 6微生物代谢调控机制在发酵工业生产中的应用教学重点、难点酶合成而诱导:酶合成的阻遏，酶浓度调节的分子机制。
发酵调控学
发酵调控学教学大纲一、课程基本信息课程名称：发酵调控学课程号（代码）：课程类别：基础课学时：40 学分：二、教学目的及要求本课程主要是基于微生物和生物化学基础课的基础上，以工业发酵过程的代谢调控为主线，介绍微生物生理生化和分子生物学知识在微生物发酵过程中的代谢调节和发酵规律，通过分析发酵过程中的各种生化反应，解开发酵过程中的各种影响因素的一般规律；通过典型代谢产物的生产以及调控方式和各种发酵参数，分析及产物合成之间的关系；计算机在发酵发酵工程中的应用。
定量生物工程研究与开发以及代谢调控的新进展。
三、教学内容第一章微生物生长与调节：微生物的生长；细胞周期；生长效率。
生长调节；运输过程。
6学时重点了解微生物生长的规律并针对不同生长周期过程中的代谢产物进行分析的手段，以及代谢产物在细胞内外的运输方式及生理过程。
第二章微生物的基础代谢：能量代谢原理；微生物分解代谢；微生物组成代谢 6学时重点掌握能量的动力学原理及微生物在不同代谢途径的产能方式，不同微生物体内存在的各个代谢途径之间存在的合成与分解产物之间的交互关系。
第三章代谢调控与代谢工程：酶活性的调节；酶合成的调节；代谢系统的分子调控机制；代谢调控；代谢工程 8学时重点掌握微生物发酵过程中代谢调控机理，分子水平酶的活性调节作用，微生物体内的多种代谢调节方式，以及分子水平的代谢调控机制第四章微生物次级代谢与调控：次级代谢的概念；次级代谢物生物合成前体；次级代谢物生物合成原理；抗生素的生物合成；微生物次级代谢物作用的调控 8学时熟悉大量的微生物次级代谢调控实例，说明微生物次级代谢的合成路线、前体来源，说明代谢与调控的关系和作用。
第五章发酵过程控制与优化：发酵过程技术原理；发酵条件的影响及其调控；泡沫对发酵的影响及其调控；发酵染菌的防治及处理；基因工程菌培养与表达 8学时了解发酵过程的技术原理，发酵模式的建立依据，以及各种发酵方式的实例，和发酵过程有关的各种影响因素和控制手段。
发酵调控学1
课程内容
4 发酵过程控制 (1)控制的策略 (2)参数的指导作用 (3)参数相关分析 (4)过程控制的评价
主要参考书
现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化 学工业出版社，北京。2002年1月 Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JB Biotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing. Rehm H-JB
微生物发酵代谢调控与发酵过 程优化技术
代谢调控是研究内在的调节机制， 而过程优化则是外在控制，是建 立在相关参数的分析上的，这两 个方向相辅相成，前者为后者的 基础，而后者是使理论变为现实 的手段。
二十一世纪的生命科学
Industrial biotechnology:
Gateway to a more sustainable future
如亲本培养物沉积在滤膜上之前用 氚标记的胸苷使细胞带上标记，则 结合到洗脱细胞的标记量与结合到 亲本培养物那一年龄细胞的标记量 成正比。
细胞周期
细胞周期
其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少 一倍的放射性标记。 可以分别求得C和D值
3 同位素示踪法
另一种研究细胞周期的方法是通过 蔗糖密度梯度离心，使一对数生长 的培养物沉淀, 收集最上层的细胞， 在含有氚-标记胸苷的生长培养基上 生长，测量其DNA合成速率。
染色体复制的启动
启动总是在染色体上的专一位置上进行。 此位点称为复制或染色体原点。在大肠 杆菌此位点很靠近ilv座位。 在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个 方向沿染色体运行，大约在离原点180度 地方相遇。
染色体复制的启动
启动的频率取决于细胞量增长的速 率，即生长停止，启动也随着停止 是预料中的事。
发酵工艺控制课件
意义：控制菌的生长速率、培养中期 的代谢活动，延长合成期，推迟菌体 自溶；加入前体增加合成产物的中间 体，从而使产量大幅度提高。
发酵工艺控制课件
中间补料内容 1、碳源
3、前体
2、氮源 4、无机盐和水
控制和引导产生菌在培养过 程中，特别ห้องสมุดไป่ตู้中期的生化代谢 活动向着有利于产物合成和分 泌的方向发展。发酵工艺控制课件
• 有些金属离子特别是二价阳离子是酶的 激活剂，适当时间补入无机盐可以提高 酶活，从而提高产量。
发酵工艺控制课件
中间补料的优缺点
优点：推迟菌的自溶期，延长产物分泌期， 维持较高的生产速率，增加发酵液总体 积，使产量大幅度上升。现在大多数抗 生素都采取补糖措施。
缺点：补糖使工艺复杂化，而且增加了 染菌机会。因此工厂管理十分重要，一 定要严格消毒，包括料液消毒和管道消 毒。
发酵工艺控制课件
并非添加速率越大越好，据研究表明，加 入苯乙酸浓度越高，苯乙酸的利用率越低。 苯乙酸可被菌氧化，先氧化成邻羟苯乙酸， 然后苯环被破坏形成α－酮戊二酸，再经 TCA循环氧化为CO2和H2O，苯乙酸作为碳 源被消耗掉。
苯乙酸具有毒性，青霉素是借苯乙酸与 氨基酸结合形成青霉素而解毒，因此加入 前体能形成青霉素，但必须适量而不能过 量。
分批培养中微生物的生长
迟滞期
对数生长期
稳 定期
发酵工艺控制课件
死亡期
第三节 发酵控制与中间补料
中后期营养不足，菌体过早衰老
补
料 初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大
的
理 由
初始培养基中葡萄糖过多引起抑制
发酵过程优化与控制PPT课件
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3
发酵过程技术原理
分批发酵 补料-分批发酵 半连续发酵 连续发酵
.
4
分批发酵
几个重要参数：
为比生长速率,h-1； -qs 为比基质消耗速率,(g/g)/h； qp 为比产物形成速率,(g/g)/h 。
uX dX dt
q xX d S dt
补充养分，同时解除/消弱代谢产物的抑制。
不足：
丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体；送去提炼 的发酵液体积更大；丢失代谢产生的前体物；利于非产生 菌突变株的生长。
实施：海洋微藻合成藻红素和EPA。
需要摸索最佳的培养基更新速率。
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连续发酵
发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速 放料，维持发酵液原来的体积。（恒化培养）
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1
发酵过程优化与控制
发酵
狭义——厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成 乳酸或乙醇等的分解代谢过程。
广义——微生物把一些原料养分在合适的发酵 条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过 程。
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2
发酵是一个很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素： 菌种性能、培养基组成、原料质量、灭菌条件、种子 质量、发酵条件和过程控制等
pH变化会影响酶活，菌对基质的利用效率和细
胞结构，从而影响菌的生长和产物的合成。
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选择最适发酵pH的原则是获得最大比生产速率和
适当的菌量。
分阶段pH控制策略
如何控制发酵液pH？
基础培养基的配方；通过加酸碱或中间补料 例如，青霉素发酵，通过调节加糖速率来控制pH；链 霉素的生产，补充NH3来控制pH，同时为产物合成提 供氮源。
培养液pH可反映菌的生理状况：pH上升超过最适值，意 味着菌处于饥饿状态，可加糖调节；糖的过量又使pH下 降；用氨水中和有机酸需防止微生物中毒，可通过监测 培养液种溶氧浓度的变化来控制。
第八章发酵过程控制
第八章发酵过程控制
第八章发酵过程控制
2. 次级代谢物的生产调节
(1) 次级代谢的特点及与初级代谢的关系 (2) 调节方法
诱导作用 避开固有的负反馈
操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 初级代谢物的调节作用 能荷调节 e.g.磷酸盐影响金霉素的合成
第八章发酵过程控制
（1）次级代谢的特点及与初级代谢的关系
合成 凝结芽孢杆菌的α-淀粉酶热稳定性：55℃培养
→90℃ 保持 60min， 剩留活 性为 88%~99%； 35℃ 培 养 → 经 相 同 条 件 处 理 ， 剩 余 活 性 仅 有 6%~10%。
第八章发酵过程控制
5. 最适温度的选择与控制
定义：最适温度是指在该温度下最适于菌的生 长或产物的生成，它是一种相对概念，是在一 定条件下测得的结果。
第八章发酵过程控制
(1) 糖比消耗速率qs
Righelato假定： qs mB
m－维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项 与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以 外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程
受温度的影响，所以m也和温度相关。
B－生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说 明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。
次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受 遗传及环境因素的影响大。
次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多 数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。
次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中 的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。
第八章发酵过程控制
第四章 发酵机制及控制
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2、生产方法：
（1）天然油脂为原料：天然油脂 肥皂，废水 回收甘油
❖ 原烟台第二化工厂生产军用甘油，其副产 品……
（2）以丙烯为原料合成 ❖ 壳牌的氯化法，过乙酸法 （3）发酵法甘油生产：厌氧发酵、好氧发酵
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3、我国发酵甘油在技术上与国外主要存在以
下差距：
（1）残糖高，…… （2）规模化较少，…… 4、我国甘油市场的构成与西方发达国家相比 也有较大的差异： ❖ 中国：涂料，49%；医药食品，10% ❖ 美国：涂料，10%；医药食品，54%以上
（生物素、锰离子、镁离子、罐压等）
（3）点：柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很 低：
方法：控制培养基中的Fe2+ 的浓度
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五、柠檬酸产生菌的育种 1.透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3
诱变后，涂布，透明圈大的则好，为何？ 淀粉的水解能力。 2.显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，显色圈大的则好。
（2）HMP:6－磷酸果糖
3－磷酸甘油酸
NADPH:－酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。
（3）TCA循环:生成谷氨酸前体物质－酮戊二酸。
（4）CO2固定反应:补充草酰乙酸。 （5）乙醛酸循环:使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补充，
维持TCA循环的正常运转。
谷氨酸脱氢酶
（6）还原氨基化反应:－酮戊二酸─────→ 谷氨酸
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2.顺乌头酸酶活性的控制
该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量 生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌 体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵 过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活 性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的 浓度，可以使该酶失活。
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细胞周期
细胞周期(Cell cycle)：
细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变,完成一个活动后才能进行下一个活动。
图1细胞周期
细胞周期
•典型的真核生物细胞周期如图所示: S, M和G1, G2分别代表DNA合成,有丝分裂期和两次间隙。
•若生长速率因养分多寡而改变, S, G2和M几乎不变,只有G1改变。
发酵调控学
生物工程学院
储炬
课程内容
1微生物生长分化调节的规律
(1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞分裂的调节
(2)丝状菌生长分化的调节
2初级代谢的调节机制
(1)调节的生化基础
(2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调节、反馈调节
课程内容
3次级代谢物的生物合成的调节
(1)次级代谢物的概念
(2)生物合成的前体
(3)次级代谢物的生物合成
(4)抗生素生物合成的控制
课程内容
4发酵过程控制
(1)控制的策略
(2)参数的指导作用
(3)参数相关分析
(4)过程控制的评价
主要参考书
•现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化学工业出版社，北京。2002年1月
•Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JB
•Biotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing.
Rehm H-JB
微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术
•代谢调控是研究内在的调节机制，而过程优化则是外在控制，是建立在相关参数的分析上的，这两个方向相辅相成，前者为后者的基础，而后者是使理论变为现实的手段。
1微生物生长与调节
细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系
蛋白质合成速率与细胞长度(体积)成正比，从而与细胞年龄成正比。
(2)过滤洗脱法
将细胞粘附在固体支持物，如硝化纤维膜上，然后将其倒置，让生长培养基从上到下通过，新生的细胞便被洗脱到培养基中，呈一种特征性的振荡模式，见图1－23。
过滤洗脱法
为了控制菌体的生长，需要了解生长的方式，细胞分裂和调节的规律，测量微生物生长的各种办法，微生物生长繁殖的形式与工业生产的关系，环境变化对微生物生长的影响。因此，研究微生物的生长分化规律无疑是发酵调控原理的一个重要组成部分。
细胞周期
对于个体细胞行为，主要关心
•染色体启动、复制和分离
•新细胞壁材料的合成与插入
图2大肠杆菌的染色体复制和细胞分裂的时间分配示意图
染色体复制和细胞分裂的调节规律
•染色体复制未完成，细胞就不会分裂。不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后。
•不管生长速率如何，C和D所需时间大致不变。
•C和D可以依次或同时(指上一轮的D和下一轮的C )进行。
思考题
加倍时间最小为多少？C＝40，
在高速生长下,如细胞周期为30 min,染色体复制不能在一个周期内完成。
为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又在原点上启动。
可以把C期的启动和终止,以及细胞分裂看作是不可更改的活动顺序,称为C+D周期。
染色体复制与细胞分裂的调节
•若增代时间少于C+D时间, C+D周期重叠，其重要特征是分配到子细胞的染色体已开始新的一轮复制。这类染色体称为二叉染色体(dichotomous)。
染色体复制的启动
启动不会重新发生直到其浓度因生长而降到临界值。这种控制机制构成一种生物钟。它是以细胞体积或其它有关参数为依据。据此，染色体复制的启动频率是DNA合成速率的控制步骤。
染色体复制的启动
O/M=I启动，启动后，2O/M=I’,
I’>I不再启动，M增加，M2M，使I’逐渐下降，2O/2M=O/M=I，
细胞年龄变化较大时,细胞大小变化不大。
2同步培养(Synchrony)法
(1)密度梯度离心沉降法
按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养物分级。
H2O/D2O密度梯度沉降法:
能应用于任何度带便可分离出同质的细胞群体，随后培养。
细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系
又开始启动。
启动和复制是性质截然不同的两种过程
启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮DNA合成。
•曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因；；
•加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允许复制继续完成；
•培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有完整的染色体。
•MTG: mean generation time
细胞周期
•原核生物在低生长速率下的细胞周期,与真核生物相似。
•其染色体复制期C相当于S；
•细胞分裂期D相当于G2+M；
•C和D不随生长速率变化,只有G1可变动。细胞周期的各项活动怎样去适应生长速率变化的需要？
染色体复制与细胞分裂的调节
•染色体复制怎样与细胞分裂协调？
D＝20时，时间如何分配？
染色体复制的启动
染色体复制的启动受启动因子(origin),一种特异调节性蛋白的正向控制。当启动因子增加到某一临界水平,启动便开始。在这以后启动因子被毁或稀释。合成启动因子达到有效浓度所需的时间恰好等于培养物增代时间。
染色体复制的启动
大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细胞质量之比在各种生长速率下是一样的。这一比例实际上是染色体启动因子的浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度。当它达到一临界值时便启动新一轮的复制。启动的直接后果是启动因子的浓度提高一倍。
1镜检法
用电子显微镜观察单个细胞的生长，定时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细胞个子的变化不大。
细胞周期的研究方法
1镜检法
说明似乎存在一种控制细胞个子大小的因子，即尺寸因子(size factor),可能是启动细胞质量(initiation mass)。
1镜检法
缺点:细胞由培养液转移到固体表面,会受到干扰。
染色体复制的启动
•启动总是在染色体上的专一位置上进行。此位点称为复制或染色体原点。在大肠杆菌此位点很靠近ilv座位。
•在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个方向沿染色体运行，大约在离原点180度地方相遇。
染色体复制的启动
启动的频率取决于细胞量增长的速率，即生长停止，启动也随着停止是预料中的事。
细胞周期的研究方法