几种蛋白质测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较蛋白质分子量是指蛋白质分子中所包含的氨基酸数量和分子量之和。
确定蛋白质分子量对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
随着科技的发展，出现了多种蛋白质分子量测定方法。
本文将比较常用的几种方法：紫外吸收光谱法、凝胶电泳法、质谱法和核磁共振法。
1. 紫外吸收光谱法：该方法基于蛋白质中芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸）吸收紫外光的特性，通过测量蛋白质在280nm处的吸光度来估计蛋白质的分子量。
该方法简单、快速，不需要额外的标准物质，适用于大多数蛋白质的分子量估计。
然而，该方法对蛋白质中其他吸光物质的影响较大，且误差较大，无法提供高精度的分子量测定结果。
2.凝胶电泳法：凝胶电泳法是常用的分离和测定蛋白质分子量的方法，主要包括SDS-和聚丙烯酰胺凝胶电泳（）。
SDS-使用表面活性剂SDS使蛋白质在电场中具有相同的负电荷，根据蛋白质迁移速度的不同来估计其分子量。
通过聚丙烯酰胺分子筛效应，使蛋白质根据其分子量大小迁移至不同位置。
凝胶电泳法可以提供较高的分辨率和较准确的分子量测定结果，但需要标准物质来建立标准曲线。
3.质谱法：质谱法是一种通过测量样品分子在质谱仪中形成的离子质量和丰度信息来分析蛋白质分子量的方法。
常见的质谱技术包括基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）和液相色谱电喷雾离子源质谱（LC-ESI-MS）。
质谱法具有极高的灵敏度、分辨率和准确性，可以同时测定多个蛋白质的分子量，并且还可以提供蛋白质的部分序列信息。
然而，质谱法设备昂贵，操作复杂，通常需要专业技术人员进行操作和数据解析。
4.核磁共振法：核磁共振法是一种通过测量样品核自旋来分析分子结构和构象的方法。
对于蛋白质分子量的测定，核磁共振法通常使用质子核磁共振（^1H-NMR）或碳核磁共振（^13C-NMR）。
这些方法可以直接测量蛋白质中的原子数量，并通过相应的核磁共振谱图来确定蛋白质的分子量。
核磁共振法具有非常高的准确性和分辨率，但对于大多数蛋白质来说，需要大量的纯化样品，并且数据分析相对复杂。
蛋白质的测定方法比较
蛋白质的测定方法比较一、分光光度法1、测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。
在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2、测定步骤：①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。
取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
按同一方法做试剂空白试验。
②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。
加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。
三种常见蛋白质含量测定方法
三种常见蛋白质含量测定方法
蛋白质含量是决定植物质量的重要因素，在植物栽培及种子货架上，精确掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
目前，研究常用的植物蛋白质含量测定方法有Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种。
Kjeldahl法是一种多功能性的蛋白质定量方法，它可以测定含氮量甚至微量有机氮，此法在测定蛋白质含量方面易于操作，测试效率高， get精度也较高。
该法简单地以氨作为氮源，以硫酸释放氨，用硫酸钠将氨碱中的氨携带，然后进行缓冲及蒸发水解，最后通过酚酞形成深蓝色络合物对氮进行定量，从而间接的得到蛋白质的含量。
Bradford法同样是一种多用途的法子，它能够直接测定蛋白质中的色氨酸及胆羧酸含量，该方法的操作简便，使用成本低，测试效率高，可在一个小时内达到较高精度的测定结果。
Bradford法原理是将蛋白质及它的沉淀由蛋白质合酶结合至二价铬J络合物，从而形成一种光电的特异性比色反应。
Lowry法也是一种多功能性的定量方法，该方法能测定有机物中蛋白质、氨基酸等氮含量，以及各种物质中的亲合体，操作过程简单，精度也较高，比Kjeldahl法快7倍以上，Lowry法原理是蛋白质分解成其中的氨基酸，通过对色比色反应，底物络合过程自络合金属，再经冷酰膦处理，酰膦中色素降解，形成比色荧光，定量检测氮含量，从而间接得到蛋白质含量。
以上就是蛋白质含量测定常见三种方法。
从Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种方法，人们可以很好地掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
蛋白质的测定方法有哪些
蛋白质的测定方法有哪些蛋白质测定是一个重要的生物化学实验，用于确定样品中蛋白质的含量和纯度。
目前常用的蛋白质测定方法主要有生物化学方法、光谱法、免疫学方法和质谱法等。
下面将详细介绍这些方法。
1. 生物化学方法：生物化学方法是一种常用的蛋白质测定方法，主要包括低里氏法、比色法和滴定法等。
低里氏法基于酵素反应测定蛋白质含量，其中最常用的是双维小麦胚芽过氧化物酶法。
比色法是通过染色剂和蛋白质的反应来测定蛋白质浓度，常用的比色剂有考马斯亮蓝G-250和布拉德福棕色R-250等。
滴定法是通过滴加蛋白质溶液的滴定剂，如硝酸银溶液和碘溶液等，来测定蛋白质的含量。
2. 光谱法：光谱法是利用蛋白质在特定波长下吸收光线的特性来测定蛋白质的含量和纯度。
UV-Vis吸收光谱法是最常用的光谱法之一，根据蛋白质在280 nm处吸收的特性来测定蛋白质浓度。
近红外光谱法也可以用于蛋白质浓度的测定，因为蛋白质的结构可以在近红外区域引起光的散射和吸收。
3. 免疫学方法：免疫学方法是利用抗体与特定蛋白质发生特异性反应来测定蛋白质的含量和纯度。
常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）和免疫沉淀法等。
ELISA是一种高灵敏度的蛋白质测定方法，通过抗原与特异性抗体在单克隆板上的特异性结合来测定蛋白质的含量。
Western blotting是一种常用于检测特定蛋白质的方法，通过电泳分离蛋白质，然后用特异性抗体检测目标蛋白质。
免疫沉淀法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过共沉淀或差速离心的方式将目标蛋白质从混合物中分离出来。
4. 质谱法：质谱法是一种高分辨率的蛋白质测定方法，主要有质谱光查法（MS）和质谱对比法（MS/MS）两种。
质谱光查法通过蛋白质在质谱仪中的分子离子质量和电荷比来确定蛋白质的分子量和浓度。
质谱对比法则是将待测蛋白质与已知质量的蛋白质进行比较，从而确定样品中蛋白质的含量和纯度。
蛋白质组学方法比较
蛋白质组学方法比较蛋白质组学是研究蛋白质在细胞、组织或生物体水平上的表达、修饰和功能的科学领域。
下面是蛋白质组学中常用的方法的比较：1. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：质谱法是蛋白质组学中最常用的方法之一。
根据质量-电荷比（m/z）分析蛋白质的分子量和结构，可用于鉴定蛋白质序列、翻译后修饰和互作蛋白等。
- 优点：高灵敏度、高分辨率、可定量、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：不适用于大规模分析、需要高度精确的质谱仪器。
2. 二维凝胶电泳（Two-Dimensional Gel Electrophoresis,2DGE）：2DGE 是将蛋白质通过等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，根据蛋白质的等电点和分子量进行分离。
- 优点：分离效果好、可获得蛋白质的相对丰度、可鉴定翻译后修饰。
- 缺点：不适用于低丰度蛋白质、定量不准确、有偏性。
3. 差异凝胶电泳（Difference Gel Electrophoresis, DIGE）：DIGE 是在2DGE的基础上引入荧光标记，同时分析多个样品的差异。
- 优点：高通量、高灵敏度、定量准确、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：需要昂贵的设备和试剂、荧光标记可能影响蛋白质性质。
4. 蛋白质微阵列（Protein Microarrays）：将蛋白质固定在固相载体上，通过与样品中的蛋白质相互作用来鉴定和分析蛋白质。
- 优点：高通量、高灵敏度、可进行蛋白质互作研究。
- 缺点：需要提前知道蛋白质的种类和性质、鉴定结果受固相载体和信号放大的影响。
5. 蛋白质组测序（Protein Sequencing）：通过将蛋白质的氨基酸序列解析出来来鉴定蛋白质。
- 优点：可以获得蛋白质的全序列。
- 缺点：需要大量的蛋白质样品、操作复杂、需要特殊设备。
蛋白质定量的方法
蛋白质定量的方法蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于理解生物体的结构和功能具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的含量是许多生物科学领域研究的基础。
目前，人们已经发展出了多种方法来定量蛋白质的含量。
本文将介绍几种常用的蛋白质定量方法及其原理、优缺点和应用范围。
1. 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）HPLC是一种常用的蛋白质分离和定量方法。
它利用样品中蛋白质与流动相在分离柱中的相互作用来实现分离和定量。
HPLC方法的优点是分离效果好、重复性好、能够同时检测多个样品。
但是，该方法需要相对较高的设备要求和操作技巧，对样品预处理也较为复杂，且比较耗时。
2. 比色法比色法是一种常用的定量蛋白质的方法。
其中，低里氏试剂法和双硫键试剂法是比较常用的比色法。
低里氏试剂法是通过蛋白质与龙氏试剂（碱性铜硫脲）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
双硫键试剂法则是通过蛋白质与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
比色法具有操作简单、设备要求低等优点，但是对于不同类型的蛋白质，比色反应的敏感度和选择性可能不同。
3. 显微波特光度法（Bradford法）Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法，基于酒红素（Coomassie BrilliantBlue G-250）与蛋白质之间的相互作用产生的颜色变化。
蛋白质与酒红素结合后，溶液的吸收光谱发生变化，可测量溶液的吸光度来定量蛋白质含量。
该方法操作简单快捷，而且灵敏度较高，适用于常规蛋白质定量。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定量方法，可以通过电泳分离蛋白质并定量。
该方法通过将样品中的蛋白质在电场中进行分离，然后通过比色或者近红外成像等方法来定量。
几种蛋白质测定方法的比较
表 2 双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表 Table 2 P repare solut ions of Binr et for the standard cur ve
管号 T he num ber of t ube
0
1
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5
标准蛋白溶液 ( m L) Th e st an dard prot ein solu ti on ( m L)
管号 T he num ber of t ube
0
1
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3
4
5
标准蛋白溶液 ( m L) Th e st an dard prot ein solu ti on ( m L) 蒸馏水 ( mL) Dis til led w at er ( mL) 考马斯亮蓝液 ( m L) Coom as sie bril lian t blu e reagen t ( m L)
取适量样品, 测定 方法 与绘 制 标准 曲线 5 号管 过 程相 同, 仅用被测 样 品 代 替 标 准 蛋 白 溶 液, 根 据 被 测 样 品 的 A540 值, 在标准曲线上查 其对应 的蛋白 毫克 数, 即为 所测 蛋白溶液的含量 ( mg mL- 1 ) 。每个 样品重复三 次, 取平均
1 2 4 利用双缩脲法测定蛋白质含量 取待测样品制成蛋 白浓度 大约 在 1~ 10 mg mL-1 的 蛋
白质溶液, 加双缩脲试 剂染色 30 min, 用可见光分光光度计 进行比色, 对照标准曲线得出样 品蛋白质含量。 1 2 4 1 标准曲线的制作
取 6 支试管, 编号后按表 2 依次加入标准蛋白 溶液、蒸 馏水和双缩脲试剂。
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中国药典中测蛋白质的方法
中国药典中测蛋白质的方法在生物医药领域，蛋白质的测定是实验室常规检测的重要项目之一。
中国药典中收录了多种测蛋白质的方法，主要包括总蛋白质检测法、尿化学分析法和电泳法。
本文将详细介绍这三种方法的应用范围、实验原理、实验步骤及注意事项。
1. 总蛋白质检测法总蛋白质检测法是一种常用的实验室方法，可用于检测生物样品中总蛋白质的含量。
该方法基于双缩脲反应原理，通过测定反应后溶液的颜色变化，计算出样品中总蛋白质的浓度。
总蛋白质检测法具有操作简便、反应灵敏、重复性好等优点，适用于生物医药领域中的蛋白质含量测定。
实验步骤：(1) 准备试剂：包括双缩脲试剂A液和B液，分别储存于棕色瓶中。
(2) 制备样品：将待测样品用生理盐水或去离子水稀释至适当浓度。
(3) 加样：取适量样品加入到试管中，加入双缩脲试剂A液2mL，摇匀。
(4) 孵育：将试管置于37℃水浴中孵育15分钟。
(5) 加试剂B：取出试管，加入双缩脲试剂B液4滴，摇匀。
(6) 测定吸光度：用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定吸光度值。
(7) 计算：根据标准曲线或回归方程计算样品中总蛋白质的浓度。
注意事项：(1) 双缩脲试剂应储存于棕色瓶中，防止见光分解。
(2) 实验过程中应保持温度适宜，以利于反应进行。
(3) 注意吸光度的测量范围，避免超出仪器的测量范围而导致误差。
2. 尿化学分析法尿化学分析法是一种用于检测尿液中蛋白质的方法。
该方法通过测定尿液在特定波长下的吸光度值，来判断尿液中蛋白质的含量。
尿化学分析法具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，适用于临床诊断及生物医药研究中的蛋白质含量测定。
实验步骤：(1) 收集尿液：采集受试者的尿液样本。
(2) 加样：将试纸浸入尿液中，轻轻搅拌数次后取出。
(3) 读数：将试纸放置在尿液干化学分析仪中，读取吸光度值及相关指标。
如果仪器具有半自动或全自动功能，可以直接打印出结果。
(4) 结果判断：根据试纸上的颜色变化及仪器测得的吸光度值，判断尿液中蛋白质的含量是否正常。
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材料与方法
材料仪器 消毒牛奶 , 鸡蛋 , 酸奶 , 豆 浆 , 杏 仁露 , 0 2 mo l
收稿日期 : 2006 01 15 修回日期 : 2006 03 12 作者简介 : 李宁 ( 1982 ) , 男 ( 汉) , 山西孝义人 , 硕士研究生 , 主要从事植物生理学方面的研究。 通讯作者 : 王玉国教授 , 硕士生导师。 Tel: 0354 6288344; E mail: t gw ygn@ 126 com
Table 3 P repare solut ions of coo massie br illiant blue for the standar d curv e
管号 T he num ber of t ube 标准蛋白溶液 ( m L) Th e st an dard prot ein solu ti on ( m L) 蒸馏水 ( mL) Dis til led w at er ( mL) 考马斯亮蓝液 ( m L) Coom as sie bril lian t blu e reagen t ( m L) 0 0 1 0 5 0 1 0 2 0 8 5 0 2 0 4 0 6 5 0 3 0 6 0 4 5 0 4 0 8 0 2 5 0 5 1 0 0 5 0
表 2 双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表 Table 2 P repare solut ions of Binr et for the standard cur ve
管号 T he num ber of t ube 标准蛋白溶液 ( m L) Th e st an dard prot ein solu ti on ( m L) 蒸馏水 ( mL) Dis til led w at er ( mL) 双缩脲试剂 ( m L) Biuret reagen t ( m L) 0 0 1 0 4 0 1 0 2 0 8 4 0 2 0 4 0 6 4 0 3 0 6 0 4 4 0 4 0 8 0 2 4 0 5 1 0 0 4 0
1 2 4 利用双缩脲法测定蛋白质含量 取待测样品制成蛋 白浓度 大约 在 1~ 10 mg
mL 1 的 蛋
白质溶液 , 加双缩脲试 剂染色 30 min, 用可见光分光光度计 进行比色 , 对照标准曲线得出样 品蛋白质含量。 1 2 4 1 标准曲线的制作 取 6 支试管 , 编号后按表 2 依次加入标准蛋白 溶液、蒸 馏水和双缩脲试剂。
0 0 4 0 1 0 5 3 5 2 1 0 3 0 3 1 5 2 5 4 2 0 2 0 5 2 5 1 5 6 3 0 1 0
( mL) 0 1 m ol
L N aO H ( mL)
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以 0 管为空白 , 在 280 nm 下测定 各管中 液体的 吸光度 值 , 以各管标准蛋白毫克数为横坐 标 , 对应得 A 280 值为纵 坐标 , 做标准曲线图。 1 2 3 2 样品测定 取适量待测液用 0 1 mo l L 1 NaO H 稀释 10 倍 后装入 石英比色 皿 中 , 测 A280, 对 照 标 准 曲线 求 得 蛋 白质 含 量 ( mg mL 1 ) 。每个样品重复三次 , 取平均值。
以 0 管为空白 , 在 540 nm 下测定 各管中 液体的 吸光度 值 , 以各管标准蛋白毫克数为横坐 标 , 对应得 A 540 值为纵 坐标 , 做标准曲线图。 1 2 4 2 样品测定 取适量样品 , 测定 方法 与绘 制 标准 曲线 5 号管 过 程相 同 , 仅用被测 样 品 代 替 标 准 蛋 白 溶 液 , 根 据 被 测 样 品 的 A540 值 , 在标准曲线上查 其对应 的蛋白 毫克 数 , 即为 所测 蛋白溶液的含量 ( mg mL 1 ) 。每个 样品重复三 次 , 取平均 表3
值。 1 2 5 利用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 取待测样 品加入考马斯亮蓝 G- 250 试剂放置 5 min 后 , 用可见光分光光度计比色 , 对照标准曲线 得出样品蛋白质含 量。 1 2 5 1 标准曲线的制作
取 6 支试管 , 编号后按表 3 依次加入各试剂。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表
以 0 管 为 空 白 , 在 595 nm 波 长 下 比 色 测 定 并 记 录 A595 。以各管对应标准蛋白质含量 为横坐 标、 A 595 为纵坐 标 , 绘制标准曲线。 1 2 5 2 样品测定
取适量样品 , 加入 5 mL 考马 斯亮蓝 G - 250 试剂并 摇 匀 , 放置 5 min 后 , 在 595 nm 波长下比色记录 A 595 。根据 所测 A595 从标准曲线上查得蛋白 质含量。每个 样品重 复三 次 , 取平均值。
002115
J . Sh an xi A gri c . Univ .
学报 文章编号 : 1671 8151 ( 2006) 02 0132 03
几种蛋白质测定方法的比较
李宁
( 山西农业大学 农学院 , 山西 太谷 030801)
摘
要 : 蛋白质与生命的起源 、 存在和进化都密切相关 。 蛋白质测定涉及到生产和科研的众多领域 。 本试验用凯氏 定氮
法 、 等电点沉淀法 、 紫外吸收法 、 双缩脲法 、 考马斯亮蓝染色法分别对牛奶 、 鸡蛋 、 酸奶 、 豆浆 、 杏仁露进行蛋白 质含 量的测定 。 依此分析比较各种测氮方法 , 总结出各方法的特点及适用条件 。 凯氏定氮法是适用范围最广测定结果最 准确 的方法 , 比色法则是操作最为简捷快速的方法 , 适用于结果要求不很精确的实验 。 关键词 : 凯氏定氮 ; 等电点沉淀 ; 紫外吸收 ; 双缩脲 ; 考马斯亮蓝染色 ; 蛋白质 ; 测定 中图分类号 : Q503 文献标识码 : A
2006
李宁等 : 几种蛋白质测定方法的比较
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蛋白质溶液 , 用紫外分光光度计进行比色 , 对照标准曲线得 出样品含氮量。 1 2 3 1 标准曲线的制作
取 7 支试管ห้องสมุดไป่ตู้, 编号后按表 1 依次加入标准蛋白溶液 和氢 氧化钠溶液。
表 1 紫外吸收法测定蛋白 质含量的标准曲线溶剂配加表 Table 1
The Comparison on Various Methods for Determing Different Proteins LI Ning
( College of A gr iculture , Shanx i A gr icultur al Univer sity , T aigu Shanx i 030801 , China) Abstract: T he life o rig in, the ex istence and the evo lutio n all makes closer co nnection w ith the pr oteins T he prot ein deter mination has r elatio n to the pr oduction and the scientific r esear ch T his ex per iment tests the co ncentrion of pr oteins o f the milk, the egg , the y ogur t, the soy bean milk, and t he almo nd dew by the methods of Kjeldahl, i e U V spectr opho tomet r ic method, Iso electr ic focusing , Biur et React ion, Coom assie brilliant blue A cco rding to the analy sis of this ex per iment, we can co mpar e each method and summar ize the t raits and the suitable co nditions of va rio us methods T he method o f Kjel dahl is the most accurate method T he method of pho tometer is t he mo st simple method, and is suitable for the ex periment requir ed less precision Key words: K jeldahl; Isoelectr ic fo cusing; U V spectro pho to met ric; Biuret; Coo massie brilliant blue; Pr otein; Determining 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋 白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作 用 [ 1] 。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免 疫、物质运转、遗传等密切相关 , 其分离与定性、定量分析 是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验、诊断疾 病、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前测 定蛋白质含量的方法有多种 , 如凯氏定蛋法 [ 2] 、等电点沉淀 法、紫外吸 收法、双 缩脲法、考马斯亮蓝染色法 [ 3] 等几种方 法 , 但就方法的准确性和精密度以及应用程度而言 , 国际经 典测定方法 凯氏定氮法为首选 , 该法也是相关专业人员 必须掌握的经典测试方法之一。现在尽管有很多先进的自动 或半自动凯氏定氮仪 , 但这些仪器不仅价格昂贵 , 且需专门 试剂 , 目前尚难 普及 [ 4] 。 本实 验分 别用 以 上五 种方 法 对牛 奶、鸡蛋、酸奶、豆浆、杏仁露进行蛋 白质浓度的测定 , 通 过对实验的过程和结果的分析来总结这几种方法的适用范围 及实用性。通过分析表明 , 针对不同的待测样品以及对测定 结果准确性的要求不同 , 我们可以采用不同的方法来测定样 品中蛋白质的含量。 pH4 7 醋酸 - 醋 酸 钠缓 冲 液 , 乙 醇 - 乙 醚等 体 积 混 合液 , 浓 H 2 SO4 , 40% 氢氧 化钠 , 30% 过 氧化 氢 , 2% 硼 酸 溶液 , 0 050 mol L 1 标 准盐酸溶液 , 硫酸钾 - 硫酸铜接 触剂 , 混 合指示剂 , 标 准蛋 白 溶液 , 双 缩 脲试 剂 , 考 马斯 亮 蓝 G 250 试剂 , 离心机 , 布氏漏斗 , 抽 滤泵 , 凯氏 定氮仪 , 紫外 分光光度计 , 可见光分光光度计 。 1 2 方 法 1 2 1 利用凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品加入凯氏烧瓶中 , 加入硫 酸钾 - 硫酸铜接触 剂、浓硫酸和 30% 过氧化氢 , 放入消化炉 消化至溶 液澄清。 然后取消 化好 的样 品在 凯氏 定氮 仪上 蒸馏 定 氮 , 滴 定 , 记 录。测定样品含氮量。每个样品做三次重 复 , 取平 均值。 1 2 2 利用等电点沉淀法测定蛋白质含量 取待测样品 3 000 r min 1 离 心去 脂肪后 加醋 酸 - 醋 酸 钠缓冲液 , 产生大量絮状物后再次离心 , 得蛋白粗 品。蒸馏 水洗沉淀三次 , 离心弃上清。转移沉淀至布氏漏斗 抽滤 , 抽 干后的制品用乙醇 - 乙醚等体积 混合液洗涤二次 , 再用无水 乙醚洗二 次 , 抽 干。将沉 淀放 在 表面 皿 上风 干 , 得 蛋白 制 品。称量、记录。每个样品做三次重复 , 取平均值。 1 2 3 L1 利用紫外吸收法测定蛋白质含量 mL 1 的 取待测样品制成蛋 白浓度大约在 0 1~ 1 0 mg