外周血白细胞RNA提取并RT-PCR实验技术
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。
实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。
分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。
本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。
均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。
RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。
完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。
它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。
3、抑制内源和外源RNase。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。
二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量要比乙醇少。
异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
最全的RNA提取与RT-PCR实验步骤以及注意事项
在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA 病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。
真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。
真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。
所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。
要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。
1.RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA 降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
1.1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。
不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。
另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。
然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。
1.2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA提取及RT-PCR
（2）随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed
cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡 核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA 的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合 成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不 仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μ g/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2)进行琼脂糖凝胶电泳,确定RNA提取的情 况。
RNA降解 1、组织取出后没有马上处理或冷冻
2、样品或提取的RNA保存与-5—-20℃， 没有在
准备工作
RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活， 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须 戴手套。 2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。
（1） oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核 mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入 12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段， 由反转录酶合成cDNA的第一链。 缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’ －末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对 于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻 烦。
RNA提取,RT-PCR
72 ℃
45 S
延伸 (Extension)
上述温度变化进行 30 个循环 (cycles) 。 72 ℃ 10 min (Further extension)。
3. 将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。 其它同学课间休息。
实验操作 三、 PCR产物的电泳
1. 教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。 2. 样品制备：
dNTPs (10mM) 3 ’引物 (10mol/L)
5 l
1 l 1 l
5 ’引物 (10mol/L)
3）加去离子水 ，补足50l最终反应体系 4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
？ GAPDH gene 片段 (746bp)
？
（1）观察： 蓝色箭头指示的是何种DNA ？ （2）此PCR 结果存在什么问题？ 原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？
实验操作五、PCR产物的回收
挤胶法回收PCR产物：
PCR电泳结果
实验操作一、建立 PCR 反应体系
取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中， 用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂： 1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l 1. 2）加入下列试剂,，顺序可以改变
10X PCR buffer (含MgCl2 )
用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。 当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。
11)室温干燥3－5 min （根据 RNA 沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无 色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）
外周血白细胞RNA提取并RT-PCR实验技术
外周血（静脉血）白细胞RNA提取1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液↓颠倒混匀，室温放置5min↓3000rpm离心5min↓弃上清。
留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次）↓加入1ml Trizol裂解白细胞↓用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散↓用5ml注射器反复吹打（不少于10次）↓再用1ml注射器反复吹打↓加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min↓4℃离心：12000rpm 15min↓转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。
RNA产出浓度为200-300ng/μl,100μl稀释），混匀，静置15min↓4℃离心：12000rpm 10min↓弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml）↓4℃离心：7500rpm 5min↓弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干↓将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中↓－70℃冰箱保存，备用1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置）2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定RT-PCR实验A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）：1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液Oligo dT Primer （50uM） 1uldNTP mixture (10mM each) 1ulRNA模板 0.5ug～5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）O 适量至总体积为10ulRNase Free dH22、65℃保温5min后，冰上迅速冷却1min以上3、在上述离心管中继续配制下列反应液，总量为20ul上述变性后反应液 10ul5X PrimeScriptII Buffer 4ulRNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ulPrimeScriptII RTase (200U/ul) 1ulO 至20ulRNase Free dH24、缓慢混匀，轻轻用枪吹打或手指轻弹，稍离心5、42℃， 30～60min6、70℃，灭活15min后，冰上迅速冷却B、PCR实验（25ul反应体系）：Taqmix 12.5ul引物1（上游）（10～20nM） 0.5ul引物2（下游）（10～20nM） 0.5ulcDNA 2ul（可调整）超纯水加至总体积25ulPCR步骤：1、Hold on 94℃ 5min2、Cycle 94℃ 40s3、退火温度： X℃ 40s4、72℃ 40s repeat “2～4步骤”5、72℃ 10min6、4℃ 60min琼脂糖凝胶电泳1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min 后冷却至60～70℃左右加入5ul EB溶液。
总RNA的提取,RT-PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
外周血白细胞基因组提取
外周血白细胞基因组提取展开全文NaI提取法提取外周血白细胞基因组：实验步骤：1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm 离心12min。
2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。
3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。
4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm 离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。
6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。
7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
常用的外周血白细胞基因提取方法：试验原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。
DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。
蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。
当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。
离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。
酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。
氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。
抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
试验步骤：1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。
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外周血（静脉血）白细胞RNA提取
1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液
↓
颠倒混匀，室温放置5min
↓
3000rpm离心5min
↓
弃上清。
留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次）
↓
加入1ml Trizol裂解白细胞
↓
用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散
↓
用5ml注射器反复吹打（不少于10次）
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再用1ml注射器反复吹打
↓
加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min
↓
4℃离心：12000rpm 15min
↓
转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。
RNA产出浓度为200-300ng/μl,100μl稀释），
混匀，静置15min
↓
4℃离心：12000rpm 10min
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弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml）
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4℃离心：7500rpm 5min
↓
弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干
↓
将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中
↓
－70℃冰箱保存，备用
1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置）
2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定
RT-PCR实验
A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）：
1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液
Oligo dT Primer （50uM） 1ul
dNTP mixture (10mM each) 1ul
RNA模板 0.5ug～5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）
O 适量至总体积为10ul
RNase Free dH
2
2、65℃保温5min后，冰上迅速冷却1min以上
3、在上述离心管中继续配制下列反应液，总量为20ul
上述变性后反应液 10ul
5X PrimeScriptII Buffer 4ul
RNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ul
PrimeScriptII RTase (200U/ul) 1ul
O 至20ul
RNase Free dH
2
4、缓慢混匀，轻轻用枪吹打或手指轻弹，稍离心
5、42℃， 30～60min
6、70℃，灭活15min后，冰上迅速冷却
B、PCR实验（25ul反应体系）：
Taqmix 12.5ul
引物1（上游）（10～20nM） 0.5ul
引物2（下游）（10～20nM） 0.5ul
cDNA 2ul（可调整）
超纯水加至总体积25ul
PCR步骤：
1、Hold on 94℃ 5min
2、Cycle 94℃ 40s
3、退火温度： X℃ 40s
4、72℃ 40s repeat “2～4步骤”
5、72℃ 10min
6、4℃ 60min
琼脂糖凝胶电泳
1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min 后冷却至60～70℃左右加入5ul EB溶液。
2、待凝胶凝固后移至电泳槽中，负极为上样孔位置，约10ul/孔
3、电压100V 50min（根据分子大小）
4、紫外透射仪上初步观察条带，并使用凝胶成像分析仪拍照储存
氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。
DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。
但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA
脱离，否则DNA会释放到水相。
不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。
所以不要剧烈震荡。
异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。
氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用
通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧
异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。