RTPCR和realtimePCR原理及步骤
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
real time RT-PCR
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
Molecular Beacons
原理：荧光谐振能量传递（ 原理：荧光谐振能量传递（FRET） ）
环
环与目标序列完全配对
茎
荧光素
茎由互补配对的序列组成
淬灭剂
Molecular Beacons 优点
对目标序列有很高的特异性 ——SNP检测最灵敏试剂之一 SNP检测最灵敏试剂之一 SNP 荧光背景低
朱红 空白 87.3
HC 、HSC 2d 1 HSC 4d 、 HSC 2d 2 88.3
63度20s 度
HSC 2d 1 、 HSC 4d 88.3
65度20s 度
标准曲线制备
体外转录RNA 体外转录 体外合成ssDNA 体外合成 纯化的质粒dsDNA 纯化的质粒 cDNA PCR产物 产物 将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进 将待测基因的 产物用胶回收试剂盒进 行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标 行纯化，然后按 倍梯度稀释即可得到标 准品，用于做标准曲线。 准品，用于做标准曲线。
Molecular Beacons 缺点
设计困难
只能用于一个特定的目标 价格较高
TaqMan
TaqMan
荧光素 淬灭剂
探针
水解型杂交探针
TaqMan
目标特异性探针 5’ 为荧光素， 3’ 为淬灭剂
5’ 荧光素 3’淬灭剂
与目标序列互补
TaqMan
R F Q R
工作原理
报告基团被淬灭
R 报告基团 Q 淬灭基团
Ct值的概念 Ct值的概念
Ct值的定义是 值的定义是PCR扩增过程中 ， 扩增产物 扩增过程中， 值的定义是 扩增过程中 (荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期） 荧光信号） 荧光信号 到达阈值时（进入指数增长期） 所经过的扩增循环次数 所经过的扩增循环次数
RT-PCR_原理介绍
Real-time PCR(RT-PCR) 原理介绍实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
RTPCR和realtimePCR原理及步骤
绝对定量与相对定量的定义
绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究
相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域 值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ）。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
标准品
标准品梯度稀释方法
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA������ 使用方便--不必设计复杂探针������ 非常灵敏������ 便宜
其他荧光标记方法
Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设 计相 对简单 Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析
分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试 剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高
RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤
PCR定义
聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时 间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子 生物学技术。
多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有 活性，因此反应体系自动往复多次地进 行对所需的DNA的片段的酶促合成，使 反应产物按指数增长，所以命名为聚合 酶链式反应。
RT PCR的原理和操作
Real-time PCR概論Introduction自從聚合酶連鎖反應(PCR)技術開發至今，幾乎是分子生物學中最被普遍使用的技術。
PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續擴增目標DNA片段。
在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR 為基礎的技術都被廣泛的應用，例如多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)、逢機增幅多態型-聚合酶連鎖反應(RAPD-PCR)、序列特徵化增幅區域(SCARs)、聚合酶連鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等。
其中以Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸被提高，除了反應時間大量的縮短之外，儀器及技術亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的多項優點。
What is Real-time PCRReal-time PCR，顧名思義可以視為兩個部份，”Real-time”和PCR。
藉由PCR擴增的原理，使極微量的DNA放大，再經由光學系統達到即時偵測(Real-time)的效果。
每一次PCR擴增循環後，將其生成反應產物之數量記錄下來，待反應全部完成之後，以cycle number和生成產物做圖，可得到一反應曲線圖形，完整的呈現PCR反應中每一個cycle產物的生成情形，所以稱為即時定量PCR。
PCR vs. Real-time PCR一般的PCR反應，利用熱循環步驟，使目標基因以2n進行擴增，將微量的DNA目標片段放大。
最後，再利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis)進行結果分析。
我們可以經由產物的片段大小、擴增後產物生成量等等條件來判斷實驗結果是否成功。
必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析，對於反應過程並沒有做任何分析、記錄，故一般PCR反應又可稱為End-point PCR。
RT-PCR与realtime pcr
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。
Real-time PCR 所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
Real time RT-PCR是将Real time-PCR的方法用于RT-PCR中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。
RT-PCR和Real time-PCR是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是Real time RT-PCR；也可以单独使用。
就是名称有点绕，逆转录PCR先出现，所以占用了RT-PCR这个简写，等Real time-PCR技术出现后，本来按照惯例，简写也是RT-PCR，但为了与逆转录PCR相区别，还是写成Real time-PCR。