实验八亲和层析分离纯化蛋白质
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
蛋白共纯化实验报告
1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。
3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。
二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。
亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。
三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。
2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。
四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。
2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。
3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。
6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。
五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。
2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。
通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。
七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。
2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。
3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。
4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。
5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。
亲和层析纯化蛋白注意事项
亲和层析纯化蛋白注意事项以亲和层析纯化蛋白注意事项为标题，写一篇文章。
亲和层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过蛋白与配体之间的特异性相互作用，实现目标蛋白的分离纯化。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，有一些注意事项需要我们特别关注。
选择合适的亲和层析柱非常重要。
不同的亲和层析柱具有不同的亲和基团，可以与不同的目标蛋白发生特异性相互作用。
在选择亲和层析柱时，需要考虑目标蛋白的性质，如分子量、等电点、亲和基团的配对等。
同时，还需要考虑目标蛋白与其他非特异性结合物的亲和性，以便在纯化过程中有效去除杂质。
样品的预处理也是亲和层析纯化蛋白的关键一步。
在样品中含有大量的杂质，如其他蛋白、核酸、小分子化合物等。
这些杂质会影响到目标蛋白与亲和基团的结合，降低纯化效果。
因此，在进行亲和层析纯化之前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、浓缩目标蛋白等。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，温度和pH值的控制也是非常重要的。
温度和pH值可以影响到目标蛋白与亲和基团之间的结合力和特异性。
一般来说，选择适当的温度和pH值可以增强目标蛋白与亲和基团的结合，提高纯化效果。
同时，还需要注意避免温度和pH值对目标蛋白的稳定性产生不利影响。
洗脱缓冲液的选择也是亲和层析纯化蛋白时需要注意的地方。
洗脱缓冲液的选择应根据亲和基团与目标蛋白的结合力以及目标蛋白与非特异性结合物的结合力来确定。
通常，使用一系列浓度递增的洗脱缓冲液可以有效地去除非特异性结合物，提高纯化效果。
但是，洗脱缓冲液的浓度也不能太高，否则可能会影响到目标蛋白的活性和稳定性。
对于亲和层析纯化蛋白的结果评价也是需要注意的。
在纯化过程中，可以通过检测目标蛋白的纯度、活性以及其他相关特性来评价纯化效果。
同时，还需要对纯化后的目标蛋白进行保存和储存，以保证其在后续实验中的可用性和稳定性。
亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白纯化方法，但在实验过程中需要注意一些细节。
包括选择合适的亲和层析柱、样品的预处理、温度和pH值的控制、洗脱缓冲液的选择以及结果的评价等。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
在装柱过程中凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱装柱结束后其凝胶表面应平整2021610取4mgml蓝色葡聚糖溶液6mgml细胞色素c溶液2mgml重铬酸钾溶液各6滴混合即为上柱样品
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速，使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min， 取小试管20支，每管 收集1ml，观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
分离纯化蛋白质的方法及原 理
（2） 利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。
但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。
在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。
不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。
这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。
球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。
当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。
此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。
蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。
盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
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• 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋 白的原理和实验方法（第一部分）
• 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理 和方法（第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
一、实验原理
亲和层析
生物大分子与配体特异非共价可逆结合。
• 酶-底物或底物类似物 • 抗体-抗原 • 激素-受体 • 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 • 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
（二）细胞破碎 1．倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。 2．破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。
（菌液始终保持在冰浴中）
3．重复8-10遍，直至菌液清澈。
（三）离心
1．每个小组分取1-2 ml细胞破碎液， 12000 rpm，离心5 min。
2．分取50 uL上清液，4℃保存。 3．其余的上清液准备过GST柱子。
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
外源蛋白的表达和纯化
二、实验步骤
（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集
1．0.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白 表达，28℃，200 rpm培养3-6 h。
2．5000 rpm离心5 min，倒掉上清。
3．沉淀加40 ml水，5000 rpm离心5 min。
• 当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白 质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。
二、实验步骤
1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干， 安装制胶器。
2．根据下列配方制作12%分离胶。
12%分离胶
试剂名称 蒸馏水
30% 丙烯酰胺（29:1） 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。
6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将 电压调节到80V，电泳2-3h。
7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。
8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内， 加入染色液，染色30min。
10% 过硫酸铵（AP） 总体积
12%分离胶 2.5 ml 3.0 ml 2.0 ml 75 ul 10 ul 75 ul 7.5 ml
• 按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻 摇匀，迅速加入两块玻璃板间。
• 在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚 合15 min，至分离胶与水之间出现一条清 亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残 余的水。
（四）装GST柱子
1．清洗和装好层析柱，封闭出口。 2．加入2 mL PBS。 3．用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。 4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。
（五）纯化目的蛋白 1．用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3．用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4．加入1ml 洗脱液。
1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上 样缓冲液。
2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上样缓冲液
3号样，照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。 6．PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7．用分光光度计测定每一管的吸光度值，
记录读数，绘制洗脱曲线。
8．将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
一、实验原理
• 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消 除了蛋白质间原有的电荷差异。