亲和层析法
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
生物分子相互作用的实验方法与分析技术
生物分子相互作用的实验方法与分析技术生物分子相互作用是指生物体内分子之间的相互作用，包括蛋白质与DNA、RNA、低分子化合物等的相互作用。
了解生物分子相互作用的方法可以帮助我们更好地理解生命过程，从而为疾病治疗、药物研发等提供有益的指导。
下面将介绍几种常用的生物分子相互作用实验方法与分析技术。
1. 亲和层析法（affinity chromatography）亲和层析法是一种利用特定配体与目标分子的亲和作用进行分离和纯化的方法。
一般分为亲和柱层析和免疫沉淀两种。
亲和柱层析是将特定配体固定在柱子上，利用配体与目标分子的亲和作用将其吸附在柱子上，在洗脱过程中分离目标分子。
免疫沉淀则是利用特异性抗体与目标分子结合，再将抗体-目标分子复合物通过一系列的洗涤步骤分离。
2. 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation）免疫共沉淀法利用抗体特异性地结合目标分子，然后以抗体为桥梁将与目标分子结合的其他分子一同沉淀下来。
通过分析沉淀物中的分子成分，可以确定目标分子与其他蛋白质的相互作用关系。
该方法通常与免疫检测技术（如免疫印迹）相结合使用，可以用来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA等之间的相互作用。
3. 蛋白质结晶与X射线晶体衍射（protein crystallization andX-ray crystallography）蛋白质结晶与X射线晶体衍射是研究蛋白质三维结构的常用方法。
首先通过体外重组表达得到目标蛋白质，并将其进行纯化和结晶处理。
然后在适当的缓冲溶液中形成结晶，最后通过X射线衍射测定结晶体的晶体学参数，通过计算和解析来得到蛋白质的三维结构。
蛋白质结晶和X射线晶体衍射为药物研发提供了重要的结构信息，例如为针对特定蛋白质的药物设计提供靶标。
4. 双杂交法（yeast two-hybrid）双杂交法是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验方法。
该方法利用酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的生殖特点，将转录因子中的DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和激活域（activation domain，AD）分别与两个蛋白质结合。
亲和层析法 ph
亲和层析法 ph
亲和层析法（Phaffinity Chromatography）是一种分离和纯化蛋白质的方法，利用特定配体与目标蛋白之间的亲和性进行选择性吸附和洗脱。
在亲和层析法中，一种特定的配体或亲和剂（affinity ligand）被固定在亲和树脂上，例如蛋白A、蛋白G或金属离子等。
这些配体具有与目标蛋白质特异性结合的能力。
亲和层析法的操作步骤如下：
1.样品加载：将含有目标蛋白的混合物（样品）加载到装有
亲和树脂的柱上。
2.亲和吸附：目标蛋白与固定在亲和树脂上的配体发生特异
性结合，其他非目标蛋白被洗脱。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度、
温度等，使目标蛋白与亲和树脂上的配体解离，从而将目
标蛋白洗脱。
4.纯化和收集：收集洗脱液中的目标蛋白，经过后续处理获
得纯化的蛋白质。
亲和层析法能够高效、选择性地富集目标蛋白质，并且可以在非变性条件下进行操作，从而保持蛋白的活性和折叠状态。
这使得亲和层析法在生物医药研究和生产中得到广泛应用，如蛋白质纯化、抗体制备、酶分析等。
药物分析中的亲和层析法应用研究
药物分析中的亲和层析法应用研究亲和层析法（affinity chromatography）是一种基于亲和性的分离和纯化方法，广泛应用于药物分析领域。
本文将探讨亲和层析法在药物分析中的应用，并介绍其原理、操作步骤和优势。
一、亲和层析法概述亲和层析法是利用配体与目标分子之间的特异性相互作用进行分离和纯化的技术。
在药物分析中，亲和层析法通常用于研究药物与其靶标蛋白之间的相互作用、药物结合位点的鉴定和药物的筛选。
二、亲和层析法的原理1. 亲和剂的选择在亲和层析中，选择合适的亲和剂是至关重要的。
亲和剂通常是目标分子的衍生物或具有特异性结合能力的化合物，如抗体、金属离子等。
通过调节亲和剂与目标分子之间的结合条件，实现目标分子的选择性结合和纯化。
2. 亲和层析纯化步骤亲和层析法的纯化步骤一般包括样品处理、进样、洗脱和再生等过程。
首先，将样品与亲和层析柱填料之间的非特异性结合物洗脱，然后再用合适的洗脱缓冲液洗脱目标分子。
3. 分离效果评价亲和层析分离的效果主要通过检测目标分子在洗脱峰的峰面积或峰高来评价。
分离的效果好坏不仅取决于亲和剂的选择，还与样品的纯度、目标分子的亲和性以及平衡时间等因素有关。
三、亲和层析法在药物分析中的应用1. 药物与蛋白的相互作用研究亲和层析法可用于研究药物与蛋白质之间的结合特性以及药物-蛋白复合物的稳定性和解离动力学等。
通过该方法，可以揭示药物与蛋白之间的相互作用机制，为药物的设计和改进提供重要的依据。
2. 药物结合位点的鉴定亲和层析法可以用于鉴定药物在蛋白质分子中的结合位点。
通过与不同的亲和柱进行层析，可以确定药物与蛋白分子的结合位点，进而揭示药物与蛋白质之间的结构和功能关系。
3. 药物筛选与优化亲和层析法可用于筛选具有高亲和力和高选择性的药物。
通过将潜在药物与亲和剂结合，并利用洗脱步骤将药物从亲和剂中洗脱，可以筛选出具有良好亲和性的药物并进行后续的优化。
四、亲和层析法的优势1. 高选择性：亲和层析法可通过调节亲和剂和目标分子之间的结合条件，实现高度选择性的纯化和分离。
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
亲和层析法纯化荧光蛋白
亲和层析法纯化荧光蛋白简介荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究中的重要工具。
为了获得高纯度的荧光蛋白样品，可以使用亲和层析法进行纯化。
亲和层析法是一种利用目标蛋白与特定配体的高亲和力进行选择性结合的技术。
本文将介绍亲和层析法在纯化荧光蛋白中的应用，并提供一种常用的亲和层析流程供参考。
原理亲和层析法的原理基于配体-目标蛋白的相互作用。
一般来说，配体可以是某种金属离子、抗体、其他蛋白或化学修饰的小分子。
荧光蛋白的亲和层析通常使用针对荧光蛋白的抗体作为配体。
亲和层析法的步骤一般包括以下几个方面：1.准备亲和柱：将配体固定在柱子上，例如使用亲和树脂等。
2.样品处理：将含有荧光蛋白的样品经过前处理，如细胞裂解、离心、蛋白质沉淀等。
3.样品加载：将处理后的样品加载到亲和柱顶部。
4.洗脱杂质：通过调整洗脱缓冲液的条件，将非目标蛋白质洗脱。
5.荧光蛋白洗脱：通过调整洗脱缓冲液的条件，将目标荧光蛋白洗脱。
实验步骤1. 准备亲和树脂根据所用的亲和树脂种类，按照供应商提供的方法进行亲和树脂的准备。
一般情况下，亲和树脂的包装上都会有详细的说明。
在准备过程中，需要注意维持亲和树脂的稳定，避免干燥和污染。
2. 样品处理样品处理的步骤可以根据使用的样品来源的不同，进行不同的优化。
一般情况下，可以通过细胞裂解并离心，获得含有目标荧光蛋白的上清液。
如果需要增加目标荧光蛋白的表达量，可以选择合适的转染方法。
3. 样品加载将处理好的样品缓冲液均匀地加载到亲和柱顶部，避免样品直接滴注到亲和树脂上。
可以通过缓慢滴注的方式进行样品加载，这样可以避免样品在亲和树脂上积聚造成阻塞。
4. 洗脱杂质使用洗脱缓冲液进行洗脱步骤，以去除非目标蛋白质。
洗脱缓冲液的选择应该根据配体和目标荧光蛋白的亲和力进行优化。
一般情况下，可以使用逐步加深浓度的洗脱缓冲液进行洗脱。
5. 荧光蛋白洗脱通过调整洗脱缓冲液的条件，使得目标荧光蛋白与配体解离并从亲和树脂上洗脱下来。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
图8.2 亲和层析操作示意图
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。
例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯
化是不利的。
②具有与基质共价结合的基团 与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。 ③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。 ④配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的 条件，可以多次重复使用。
缺点：基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝ 10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子 离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配 体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易 挥发，所以操作不便。
凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的 总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同 的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆 球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作 用较强。
辅酶和磷酸酰苷
各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生 物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有 辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷 （adenosine 5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷 （adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶 的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶 的亲和配基。 过渡金属离子
为：
生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常 具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受 体等。
免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于 检测含量低微的样品。
偶联。
基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表 面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、
高碘酸盐、苯醌等。
活化溴化腈活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺 碳酸活性基团，它可以和伯氨（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。 反应如下：
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。 依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素： ① 正确地预计被设计的配体构像 ② 正确预计配体的亲和力 优良配体须具备的条件： ① 与待纯化的物质有较强的亲和力。 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化
金属离子亲和层析 金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，
如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利
于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸
环氧基活化法
在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合 物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
优点：活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－ C 和S－C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用 寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，没有毒性。 缺点：用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能 不适用。
配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶 性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
2、亲和作用的机理
结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键 等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似 物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合
2、基质活化
当用小分子化合为作为配体时，由于空间位阻作用，难于与配对
的大分子亲和吻合，常在母体与配体之间引入适当长度的连接臂。
要使不溶性母体与配体偶联或通过连接臂与配体偶联，必须先使 母体活化。即使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配体
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、操作流程
层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 根据配基分子大小及基团特性 配基 选择 载体 偶联
亲和层析剂
洗脱：削弱目的产物和亲和吸附配体间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
非专一性洗脱：
改变温度 改变pH值
的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子
亲和层析得到分离。 拟生物亲和层析 利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载 体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性
配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合
的配体。如生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性。
另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等。
3、偶联
经过活化和洗涤过的基质与等体积的0.2-0.5mol/L碳酸 盐缓冲液混合，缓慢搅拌2小时，或室温下过夜，以便配体和 基质充分偶联而形成固体载体。对于偶联极牢固会丧失活性 的大分子物质配体，则应在低pH值缓冲液中反应或活化基质 预先在pH8.3的碱性溶液中进行适当的水解作用，这样可提高 配体的活性。 配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联 的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活 性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。 例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2－乙醇胺、 氨基乙烷等小分子处理。
4、配体结合量的测定
配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体
的量来表示，测得的配体结合量，可作为决定亲和 吸附剂实际用量的参数，具体测定方法有直接测定 法（2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验和根据配体 的特征来进行测定）和间接测定法（推算法和根据 亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的 结合量）。