第十八章 高效液相色谱法
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱分析法剖析课件
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。
高效液相色谱法培训PPT课件
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手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
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离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
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喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
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质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法()ppt文档
（二）高压输液泵
对输液泵的基本要求： ①流量准确可调。 流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常 要求小于±0.5%。
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 ③液流稳定。 输出的液流应无脉动
④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。
⑤密封性能好，耐腐蚀
第2节 基本理论
高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同， 速率理论略有差异。 一、柱内展宽
H A B /u (C m C sm C s)u
1.涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同， A＝2λdp
高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装填，A较小。
2.分子扩散项
二、进样系统
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
的六通阀进样装置，结构如图所示：
三、分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管
与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用 得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，
高效液相色谱法()
第1节 高效液相色谱仪
一、输液系统
（一）溶剂脱气与过滤 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在 系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检 测器的正常响应。
①抽真空脱气 ②超声波振荡脱气 ③吹氦脱气
溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固 体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵
使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱方法及应用课件
七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中，可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用 C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标，用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装 填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成 糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂，如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是 近来日益受到重视的结果。
高效液相色谱法
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
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1、简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
2、什么是化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？
化学键合相：化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相，简称键合相。
①非极性键合相。
例如十八烷基硅烷（ODS）。
通常用于反相色谱。
②弱极性键合固定相。
常见的有醚基和二羟基键合相。
这种键合相可作为正相或反相
色谱的固定相，视流动相的极性而定。
这类固定相应用较少。
③极性键合相。
常用氨基、氰基键合相。
一般都用作正相色谱的固定相，但有时也用
于反相色谱。
氰基键合相与双键化合物可能发生选择性作用，因而对双键异构体或
含双键数不同的环状化合物有较好的分离能力。
氨基键合相兼有氢键接受和给予两
种性能。
对多功能基化合物有很好的分离选择性。
氨基键合相上的氨基可与糖分子
中的羟基选择性作用，因此在糖的分离中广泛使用。
在酸性介质中它还是一种弱阴
离子交换剂，能分离核苷酸。
3、什么是正相色谱？什么是反相色谱？各适用于分离哪些化合物/
正相色谱：固定相极性大于流动相极性的色谱。
主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。
反相色谱：固定相极性小于流动相极性的色谱。
适合分离非极性至中等极性的组分，由它派生的离子抑制色谱法和反相离子对色谱法，还可以分离有机酸、碱及盐等离子型化合物。
4、简述反相键合相色谱法的分离机制。
387页。
原理：将离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法，称之为离子色谱法。
应用范围：一些在可见或近紫外光区没有吸收，难于用紫外—可见检测器进行检测的无机离子等。
原理：把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。
分析酸类或者带负电荷的物质时，一般用季铵盐作离子对试剂，分析碱类或者带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐作离子对试剂。
应用范围：适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。
原理：在反相色谱中，流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，在其他条件不变时，溶质的离解程度越高，k值越小。
因此常加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，已达到分离目的。
一般来说对于弱酸，降低流动相的pH，k增大，t R增大。
对于弱碱，则需提高流动相的pH，才能使k增大，t R增大。
应用范围：适用于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。
6、亲和色谱的分离机制是什么？有何特点？
亲和色谱法（AC）是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生专一性亲合作用的物质的一种色谱方法。
亲和色谱是基于试样中组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的。
当含有亲何物的试样流经固定相时，亲和物
就与配基结合形成亲和复合物，被保留在固定相上，而其他组分则直接流出色谱柱。
然后改变流动相的pH或组成，以减弱亲和物与配基的结合力，将亲和物以很高的纯度洗脱下来。
特点：选择性高，回收率和纯化效率都很高。
7、速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？
涡流扩散项：与气相色谱中相同。
A=2λdp
纵向扩散项：B=2γDm，而Dm与流动相的黏度成反比，与温度成正比。
在HPLC中，流动相是液体，其黏度比气体黏度大得多，而且常在室温下进行操作，因此组分在流动相中的扩散系数比气相色谱的要小得多。
而且HPLC的流速一般都在最佳流速以上，这是纵向扩散项很小，可以忽略。
传质阻抗项：
固定相传质阻抗：在化学键合相色谱法中，键合相多为单分子层，即厚度可忽略，所以Cs可以忽略。
流动相传质阻抗：在HPLC中存在流动相传质阻抗Cm。
与固定相粒度dp的平方成正比，与分子在流动相中的扩散系数成反比。
静态流动相传质阻抗：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，再与固定相进行分配，因而相对晚回到流路中，引起峰展宽。
如果固定相的微孔多，且又深又小，传质阻抗就大，峰展宽就严重。
Csm与固定相粒度dp的平方成正比，与分子在流动相中的扩散系数成反比。
所以H=A+CmU+CsmU。
由于A、Cm、Csm均随dp的变小而变小，可见小的dp是保证HPLC高柱效的主要措施。
所以实验条件应该是①小粒度、均匀的球形化学键合相②低黏度流动相，流速不宜快③柱温适当。
8、试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？
17-7。
①k增大，R增大。
通过改变流动相极性来改变组分在两相中的量，若在吸附色谱或正相色谱中，提高k，则可减小流动相的极性。
②改变α，α增大，R增大。
主要通过改变流动相的配比。
③改变n，n增大，R增大。
减小颗粒直径dp；提高装柱技术（用匀浆法装柱）使λ降低；采用低黏度的流动相；采用低流速；适当增加柱长L。
9、试讨论反相HPLC的分离条件的选择。
反相HPLC常用非极性固定相，可以选择键合碳链长度不同，或含碳量、覆盖度不同的固定相，还可以选择中等极性甚至极性固定相。
以极性溶剂为流动相，常用水或水-甲醇、水-乙氰。
如果被分离物质是弱酸或者弱碱，则需选用pH一定的缓冲溶液为流动相，抑制弱酸或弱碱的解离。
10、什么叫梯度洗脱？它与GC的程序升温有何异同？
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH等。
同：都是针对性质相差较大的复杂试样采取的办法，可以改善峰形，提高分离效果。
异：控制的条件不一样。
一个是流动相的组成，一个是柱温。
（待定）
11、蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？
原理：将色谱柱流出液引入雾化器与通入的气体（常为高纯氮，有时是空气）混合后喷雾形成均匀的微小雾滴，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，而试样组分形成气溶胶，然后进入检测室。
用强光或激光照射气溶胶，产生光散射，用光电二极管检测散射光。
散射光
的强度（I）与气溶胶中组分的质量（m）有下述关系：I=km b。
特点：为通用型检测器。
适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、三酰甘油及甾体等，对各种物质有几乎相同的响应。
但是，其灵敏度比较低，尤其是有紫外吸收的组分。
12、常用的HPLC定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面积？哪些方法可以不用校正因子/
常用的分析方法是外标法内标法等。
另外对药物中杂质含量。
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