第十八章高效液相色谱法
高效液相色谱法
高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。
1.1.1色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
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三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
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现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法 定义
高效液相色谱法定义
高效液相色谱法是一种分离和分析混合物的方法。
它基于混合物在流动相和固定相之间的分配差异来实现分离。
高效液相色谱法使用高压输液系统将流动相泵入色谱柱中，待分析的混合物通过进样器注入流动相中，然后在色谱柱中进行分离。
色谱柱通常填充有特殊的固体吸附剂或化学键合相，混合物中的成分在流动相和固定相之间分配，根据其分配系数的差异而分离。
分离后的成分依次通过检测器进行检测，常见的检测器包括紫外-可见检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测到的信号被记录下来，通过对信号的分析和比较，可以确定混合物中各成分的含量和性质。
高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、适用范围广等优点，广泛应用于药物分析、环境监测、食品分析、生物化学等领域。
高效液相色谱法()ppt文档
（二）高压输液泵
对输液泵的基本要求： ①流量准确可调。 流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常 要求小于±0.5%。
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 ③液流稳定。 输出的液流应无脉动
④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。
⑤密封性能好，耐腐蚀
第2节 基本理论
高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同， 速率理论略有差异。 一、柱内展宽
H A B /u (C m C sm C s)u
1.涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同， A＝2λdp
高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装填，A较小。
2.分子扩散项
二、进样系统
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
的六通阀进样装置，结构如图所示：
三、分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管
与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用 得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，
高效液相色谱法()
第1节 高效液相色谱仪
一、输液系统
（一）溶剂脱气与过滤 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在 系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检 测器的正常响应。
①抽真空脱气 ②超声波振荡脱气 ③吹氦脱气
溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固 体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵
使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
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第十八章高效液相色谱法
15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为
Zirchrom C8柱（20cm X 4.6mn ,
5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28： 18： 54）;以黄芩苷 对照品配成浓度范围为10.3〜144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰 面积和对照品浓度求得回归方程为：
A=1.168 X 105C -1.574 X 103, r=0.9998.精密称取黄芩
颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取
1ml 于
10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶 液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为 4250701，5997670.
16 .校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量： ODS 色谱柱；甲醇-水（60:40）流动相；检测器UV280nm
对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物） 、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成 10ml 溶液，进
样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含 0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照 品溶液平均峰面积列于表
18-6。
（2）试样测定：取本品 20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔 诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物 0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表 18-6。
炔诺酮
炔雌醇 内标物 对照品溶液 1.981 X 106 5
1.043 X 10 5
6.587 X 10 供试品溶液
6
2.442 X 10
1.387 X 10
6.841 X 10
m 醇 /A 醇
0.035 10/(1.043 105) 302
m s /A s 0.0733 10/(6.587 105)
试样含炔雌醇的量：
r
A 醇 c cc
" 1.387 105 c 八 c/ \
m 醇 f 醇 m s
3.02 0.0733 10 0.449(mg)
A s
6.841 105
每片含炔雌醇的量： 0 449 ,
0.449 60.3 (0.0369mg/ 片)
732.8
17.测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品
解:
c 样 /10 4250701 61.8
5997670
w%
50c 样 10 6
100% 17.4%
0.1255
A 样
各0.2000g配成混合溶液。
测得峰面积分别为 3.60, 3.43 和4.04cm2。
称取0.2400g内标物和试样0.8560g同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为 4.16, 3.71 和4.54cm2。
计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
18 .计算在反相色谱中甲醇—乙腈—水（60:10:30 ）的强度因子。
如果改用四氢呋喃—甲醇—水，水的含量不变，为了保持相同的洗脱强度，甲醇的比例是多少？
设改换溶剂后，甲醇的比例为x，则
x = 0.687 = 68.7%
19.用15cm长的ODS柱分离两个组分。
柱
效
n=2.84 x 104m-1;测得t°=1.31min ;组分
的t R1 4.10min; t R2=4.45min。
(1)求k、k?、
可否达1.5?
解:(1)k
1
t R/'t R1 t0 4.10 1.31
t0t0 1.31
⑵由R f
R2L1，则 1.02
R2
0.15
L20.30
a、R值。
（2）若增加柱长至30cm,分离度R
2.13
R 2 = 1.4（达不到1.5）
解：f黄m黄/A黄A s
m s/A s A黄
3.60
3.43
1.05
解：S混S甲甲+ S乙乙+ S水水 3.0 0.60+ 3.2 0.10+ 0 0.30 2.12。