第十八章高效液相色谱法
高效液相色谱分析法剖析课件
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。
高效液相色谱法培训课件
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
1
第一节 概 述
11
第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀， 密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法()ppt文档
（二）高压输液泵
对输液泵的基本要求： ①流量准确可调。 流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常 要求小于±0.5%。
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 ③液流稳定。 输出的液流应无脉动
④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。
⑤密封性能好，耐腐蚀
第2节 基本理论
高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同， 速率理论略有差异。 一、柱内展宽
H A B /u (C m C sm C s)u
1.涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同， A＝2λdp
高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装填，A较小。
2.分子扩散项
二、进样系统
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
的六通阀进样装置，结构如图所示：
三、分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管
与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用 得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，
高效液相色谱法()
第1节 高效液相色谱仪
一、输液系统
（一）溶剂脱气与过滤 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在 系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检 测器的正常响应。
①抽真空脱气 ②超声波振荡脱气 ③吹氦脱气
溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固 体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵
使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱方法及应用课件
七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中，可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用 C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标，用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装 填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成 糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂，如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是 近来日益受到重视的结果。
高效液相色谱法
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
第十八章 高效液相色谱法 - 章节小结
一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。
（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。
（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。
（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。
（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。
（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。
（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。
（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。
（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。
（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。
（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。
用于度量分配色谱的溶剂强度。
P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。
（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。
（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。
2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。
A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。
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第十八章高效液相色谱
法
Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
第十八章 高效液相色谱法
15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含%三乙胺，磷酸调）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为～ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=××103，r=.精密称取黄芩颗粒，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶液（ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样
A A c =c 599767042507018.6110
/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含ml 内标物、ml 炔诺酮和ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（片）。
研细后称取（约相当于炔诺酮），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物ml ）。
测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）
解：02.3)
10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇
醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅
⋅=醇
醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608
.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各
0.2000g 配成混合溶液。
测得峰面积分别为, 和4.04cm 2。
称取0.2400g 内标物和试样0.8560g 同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为, 和4.54cm 2。
计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
解：05.143
.360.3A A A /m A /m f s s s ====黄黄
黄黄 18．计算在反相色谱中甲醇－乙腈－水（60:10:30）的强度因子。
如果改用四氢呋喃－甲醇－水，水的含量不变，为了保持相同的洗脱强度，甲醇的比例是多少
解：12.230.0010.02.360.00.3S S S S =⨯⨯⨯=ϕϕϕ=＋＋＋＋水水乙乙甲甲混
设改换溶剂后，甲醇的比例为x ，则
x = = %
19．用15cm 长的ODS 柱分离两个组分。
柱效n =×104m –1；测得t 0=；组分的10.41R =t min ；
2R t =。
(1)求k 1、k 2、α、R 值。
(2)若增加柱长至30cm ，分离度R 可否达
解：(1) 13.231
.131.110.4t t t t '
t k 00R 0R 111=-=-== (2) 由212221
L L R R =，则30.015.0R 0.122
2= R 2 = (达不到。