亲和层析原理和步骤
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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06.05.2021
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
06.05.2021
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
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亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
亲和层析的原理及应用
亲和层析的原理及应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术方法。
它基于生物分子之间的特异性相互作用，例如抗原与抗体的结合。
亲和层析通过利用这种特异性相互作用，将目标分子从混合物中有效地分离出来。
亲和层析可以用于纯化蛋白质、分离细胞、筛选药物等多种应用。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的相互作用。
在亲和层析中，通常使用的是一对具有特定相互作用的分子，例如抗原与抗体、配体与受体等。
这对分子中的一个部分被固定在固相介质上，而另一个部分则与目标分子发生特异性相互作用。
亲和层析的步骤包括：•预处理：选择适当的固相介质，并将其与特异性相互作用的分子配对。
固相介质可以是固定在柱子或颗粒上的化学物质。
•样品加载：将待分离的混合物样品加到预处理后的固相介质上。
目标分子与固相介质上的特异性配对分子发生结合。
•洗涤：用缓冲液将非特异性结合的物质洗掉，以减少背景噪音。
•洗脱：用特定的洗脱液冲洗固相介质，破坏特异性相互作用，使目标分子从固相介质上解离出来。
•收集纯化物：通过收集洗脱液中的目标分子来获取纯化物。
3. 亲和层析的应用亲和层析在生物科学研究和工业领域中得到了广泛的应用。
以下是亲和层析的一些常见应用：3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于纯化蛋白质。
通过将特异性配对的分子与待分离蛋白质结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
亲和层析在蛋白质研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
3.2 细胞分离亲和层析可以用于分离特定种类的细胞。
通过将细胞与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标细胞从混合物中分离出来。
这在细胞学研究和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
3.3 药物筛选亲和层析可以用于筛选药物候选物。
通过将潜在药物分子与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以筛选出具有特定相互作用的药物候选物。
这在药物研发过程中有着重要的应用价值。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以用于DNA/RNA的纯化。
亲和层析原理和步骤
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
载体
实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
KL：解离常数 E： 酶
L： 底物
E+L
KL
EL
EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
倪培华-检验系-凝胶层析
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（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
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（二）配基的选择
1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团
亲和层析 Affinity Chromatography
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一、原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术
➢ 寻找配基 ➢ 配基固定化 ➢ 制成亲和层析柱
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2
基本过程 •固相化
+
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3
吸附
+
+ 洗 脱
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倪培华-检验系-凝胶层析
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以酶和底物为例：
KL：解离常数 E： 酶
L： 底物
KL
E+L
EL
EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处理 用弱酸或弱碱溶液处理
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三、特点
1、一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、可去除已变性或部分降解物质
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四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
洗脱液pH值
离子强度
梯度洗脱
（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱 会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。
断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 （3）专一性洗脱
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4、亲和柱的再生：
已使用过和柱，经过再生处理，去除非特 异吸附的杂质后，可重复使用
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2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足
纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
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（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
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激素或药物： 受体，载体蛋白
外源凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
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（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
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（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基
质上制成固相化吸附剂
载体的排斥效应 载体的空间障碍
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二、亲和层析分离
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高
有效吸附
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洗脱方法
（1）非特异性洗脱：改变
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
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载体
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4
解吸
+
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载体
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固相化 再生
样品
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常见具有专一性亲和力的生物分子对：
酶：
基质类似物，抑制剂，辅酶
抗体：
抗原，病毒，细胞
细胞：
细胞表面特异蛋白，外源凝集素
核酸：
互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶