亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
亲和柱层析原理
亲和柱层析原理
亲和柱层析原理是一种分离和纯化生物大分子的方法，它基于生物大分子之间的特异性相互作用，利用亲和柱将目标分子从混合物中分离出来。
亲和柱层析原理的应用范围非常广泛，包括生物医学、生物技术、食品工业等领域。
亲和柱层析原理的基本原理是利用亲和柱上的特定配体与目标分子之间的特异性相互作用，将目标分子从混合物中分离出来。
亲和柱的配体可以是蛋白质、多肽、核酸、糖类等，这些配体与目标分子之间的相互作用可以是氢键、离子键、范德华力等。
在亲和柱层析过程中，混合物通过亲和柱时，非目标分子会被洗脱，而目标分子则会与亲和柱上的配体结合，最终通过洗脱目标分子的方式得到纯化的目标分子。
亲和柱层析原理的优点是选择性高、分离效果好、操作简单、适用范围广。
亲和柱层析可以用于分离和纯化各种生物大分子，如蛋白质、核酸、糖类等。
在生物医学领域，亲和柱层析被广泛应用于药物研发、生物标记物的检测和分离、蛋白质结构研究等方面。
在生物技术领域，亲和柱层析被用于生产重组蛋白、酶、抗体等生物制品。
在食品工业领域，亲和柱层析被用于分离和纯化食品中的营养成分、添加剂等。
亲和柱层析原理是一种非常重要的生物分离和纯化方法，它具有选择性高、分离效果好、操作简单、适用范围广等优点。
随着生物技
术的不断发展，亲和柱层析在生物医学、生物技术、食品工业等领域的应用将会越来越广泛。
生物制药工艺学名词解释
1 Biologics 生物制品：一般指的是用微生物（包括细菌，噬菌体，立克次体病毒等）为生物代谢产物，动物毒素，人或动物的血液或组织等加工而制成的预防，治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂，主要指菌苗，疫苗，毒素，应变原与血液制品等。
2 Electroporation 电穿孔：是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，外界环境中的DNA穿孔而入，进入细胞，最终进入细胞核内部得的方法。
该方法既适合于贴壁生长的细胞，也适合用于悬浮生长的细胞，既可用于瞬时表达也可用于稳定转染。
3 Microcarrier culture 微载体培养：微载体培养是使细胞贴附在微小颗粒载体上，它创造了相当大的贴附面积，供细胞贴附生长、增殖。
载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使细胞自由悬浮于培养基内，充分发挥悬浮培养的优点。
4 Conventional filtration 常规过滤：是指料液流动方向和过滤介质垂直的过滤方式。
常规过滤时，固体颗粒易被填塞在过滤介质上，形成滤饼。
料液必须穿过滤饼和过滤介质的微孔。
恒压下，随着滤饼厚度的增加，滤液不断减慢。
5 SCF 超临界流体：是指处于超临界温度（TC）和超临界压力（PC）以上的特殊流体。
当气体物质处于其临界温度和临界压力以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，因此，超临界流体相既不同于一般的液相，也有别于一般的气相，具有许多特殊的物理化学性质。
6 Adsorption method 吸附法：指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。
7 Compound affinity 复合亲和力：即吸附剂的亲和结合过程，既涉及离子效应的应用，又有疏水作用，且这两种弱的作用还彼此增强，其结果使亲和力大大增强。
8 Thymus hormones 胸腺激素：胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面的影响。
蛋白质亲和层析
蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。
该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。
以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。
一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。
通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。
常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。
二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。
2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。
3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。
去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。
4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。
5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。
6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。
三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。
2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。
3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。
4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。
蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。
亲和层析
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
生物制药工艺学试题及答案
生物制药工艺学名词解释第一章：1. 药品：一定剂型和规格的药物并赋予一定的形式（如包装），而且经过有关部门的批准，有明确的作用用途。
药物：能影响机体生理、生化和病理过程，用以预防、诊断、治疗疾病和计划生育的化学物质。
2. 生物药物Biopharmaceuticals：以生物体、生物组织或其成份为原料综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。
3. 生物活性Biological activity,Bioactivity：对活组织如疫苗有影响的特性。
4. 酶工程enzyme engineering：酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。
5. 固定化酶immobilized enzyme：是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。
6. 组合生物合成combinatorial biosynthesis（组合生物学combinatorial biology）：应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇，产生一些非天然的化合物。
7. 药物基因组学：一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物反应的科学。
8. 凝聚作用coagulation：指在电解质作用下，胶粒粒子的扩散双电子层排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，使胶体粒子发生聚集的过程。
9. 萃取extraction：将物质从基质中分离出来的过程。
一般指有机溶剂将物质从水相转移到有机相的过程。
10. 反萃取stripping/back extraction：将萃取液与反萃取剂相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。
11. 萃取因素/萃取比：萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。
12. 分离因素separation factor：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。
13. 双相萃取技术two-aqueous phase extraction：利用不同的高分子溶液相互混合可产两相或多相系统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
亲和层析法原理
亲和层析法原理
亲和层析法的原理是基于生物分子之间的特异性亲和力进行分离的。
亲和层析的基本原理是利用生物分子间的亲和力，将一个分子固定在不溶性基质上，然后利用分子间的亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
在亲和层析时，首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。
然后将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose-4B等。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。
亲和层析法的应用范围非常广泛，可以用于分离纯化各种生物大分子，如蛋白质、酶、抗体、激素等等。
由于亲和层析法的分离效果非常好，因此可以获得高纯度、高活性的生物大分子，在生物工程、生物制药等领域具有重要的应用价值。
如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
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一、亲和层析基本知识
亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专
一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一
种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特
异性亲和色谱。
这种特异可逆结合的物质很多，如
抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的
这种特异亲和能力又叫亲和力。
亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为
配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认
为是激素的配体。
其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。
然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
二、固相载体的选择
对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。
一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。
因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。
其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。
连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。
载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。
载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。
再者，载体的组成大小也应均匀。
高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。
配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。
这不是我们所希望的。
一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。
三、配体的选择
亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。
配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
之间的桥梁。
配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。
配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。
常用的配位体如下：
（1）三嗪染色剂，用于蛋白质的纯化；
（2）酶的底物或偶联因子，用于特定酶的纯化；
（3）抗体，用于相应的抗原；
（4）蛋白质A，用于IgG抗体的纯化；
（5）单链寡核苷酸，用于互补的核酸如mRNA，或特定的单链DNA序列；
（6）凝集素，用于特定的单糖亚基。
正确地选择合适的配体以及合适的结合方式，对获得具有优良分离效果和较大容量的载体同样具有重要作用。
能与分离物质牢固、特异和可逆结合的物质都可以作为配体。
选择配体有两个条件：第一是生物大分子与配体间具有合适的亲和力，亲和力太强，洗脱条件剧烈，易造成生物大分子失活，亲和力太小，解离容易，结合率不高。
第二是配体要具有双重功能，既有可牢固与载体结合的基团，结合后又不影响生物大分子与配体间的亲和力。
亲和色谱要取得成功，配体结合在载体上并不是唯一的因素。
具有同等重要的是要完全地从载体上除去非共价结合的配体。
因此，应当十分认真地清洗并检查清洗的情况。
与载体共价偶联酶的功能团包括：
(1)氨基：赖氨酸的ε—氨基和多肽键N末端的α－NH2。
(2)羧基：天门冬氨酸的β－羧基，谷氨酸的α—羧基和末端的α—羧基。
(3)酚基：酪氨酸的酚环。
(4)羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基。
．
(5)巯基：半胱氨酸的巯基。
(6)咪唑基：组氨酸的咪唑基。
(7)吲哚基：色氨酸的吲哚基。
四、配体与载体之间的偶联
琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。
琼脂糖凝胶结构开放，通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性能也好。
琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体，亲和色谱中最为常用的琼脂糖凝胶的型号是Sepharose–4B。
在琼脂糖与溴化氰活化后，再与生物大分子结合形成亲和色谱填料是亲和色谱中最为常
用的一种。