亲和层析法
第五节 亲和层析
早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、 提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行 分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性 物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用， 如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互 补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大 分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层 析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆 结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层 析介质称为载体。
五、亲和色谱操作条件的选择
1．吸附条件的选择 (1）吸附反应条件 吸附条件最好是自然状态下 配体与目的分子之间反应的最佳条件，如缓冲液中 盐的种类、浓度及pH等条件。如果对配体和配基 之间的结合情况不太了解，就必须对盐种类、浓度 和缓冲液的pH进行条件摸索。如果对配体和蛋自 的结合情况比较了解，可以人为设定反应条件，促 进吸附。例如，金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白 IgG之间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐 浓度、调节pH来增强吸附。 (2）流速的控制 流速也是影响吸附的一个因素 流速不能太快；否则，影响吸附程度。
2、常用载体
（1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差， 不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特 异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用 不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有 关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定 相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
在亲和层析中常用小分子化合物 (如小分子底物、辅 酶、抑制剂等) 作为配基亲和吸附大分子物质 (如酶 等) 。当配基小分子与载体相连接时，载体所形成的 空间位阻会影响到配基与亲和物的密切吻合，往往 不能形成有效的吸附。活化后的琼脂糖要求与带游 离氨基的配基相连接，如果配基不具有游离的氨基， 就无法与载体相连接。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
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亲和层析法
■ 金属螯合层析法：
imidazole
固相载体
C-COபைடு நூலகம்H
-O-C-C-C-O-C-C-C-N
OH
OH C-COOH
His
Ni His
His
Protein
elution
Metal Chelate Affinity Chromatography
Juang RH (2004) ECX
■ 亲和层析法实例的原始材料：
Superxoide dismutase (SOD)
■ 疏水性及反相层析法原理：
HIC (liquid-solid)
C18 = -C18H37
Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid)
Polar solvent
Polar solvent
Non-polar solvent
Elution volume (mL)
50
400
Pharmacia HIC
选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的 难题。 填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相 组合最佳分离纯化工艺
蛋白质工业化分离纯化流程图 合成（发酵，组织培养，多肽合成）提取和浓 缩（匀化，离心，过滤，液-液萃取）预分离 （吸附，沉淀，液—液萃取）精细分离和纯化 （色谱）浓缩（超滤，排阻色谱）无菌过滤 和干燥或结晶）
OO - NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N
O
N-Succinimide 琥珀酰亚胺
- O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - C Epoxy
OH
O
spacer arm
■ 各种亲和性载体及其专一性基团：
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
亲和层析法 ph
亲和层析法 ph
亲和层析法（Phaffinity Chromatography）是一种分离和纯化蛋白质的方法，利用特定配体与目标蛋白之间的亲和性进行选择性吸附和洗脱。
在亲和层析法中，一种特定的配体或亲和剂（affinity ligand）被固定在亲和树脂上，例如蛋白A、蛋白G或金属离子等。
这些配体具有与目标蛋白质特异性结合的能力。
亲和层析法的操作步骤如下：
1.样品加载：将含有目标蛋白的混合物（样品）加载到装有
亲和树脂的柱上。
2.亲和吸附：目标蛋白与固定在亲和树脂上的配体发生特异
性结合，其他非目标蛋白被洗脱。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度、
温度等，使目标蛋白与亲和树脂上的配体解离，从而将目
标蛋白洗脱。
4.纯化和收集：收集洗脱液中的目标蛋白，经过后续处理获
得纯化的蛋白质。
亲和层析法能够高效、选择性地富集目标蛋白质，并且可以在非变性条件下进行操作，从而保持蛋白的活性和折叠状态。
这使得亲和层析法在生物医药研究和生产中得到广泛应用，如蛋白质纯化、抗体制备、酶分析等。
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2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。
依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：
① 正确地预计被设计的配体构像
② 正确预计配体的亲和力
优良配体须具备的条件：
① 与待纯化的物质有较强的亲和力。
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 不利的。
亲和层析载体的组成 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。
原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作 为固定相吸附剂；
当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和 固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合， 其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出；
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。
拟生物亲和层析
利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程 亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载
体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
②具有与基质共价结合的基团
与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。
③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。
金属离子亲和层析
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基， 如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利 于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸 的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子 亲和层析得到分离。
④配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的 条件，可以多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性
配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
➢ 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合 的配体。如生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶 性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
2、亲和作用的机理
结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键 等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离 子、螯合剂等。
亲和层析法
主要内容
亲和层析法的基本介绍 制备方法 操作过程
亲和层析法的应用
1、生物亲和作用
生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种 识别并结合的能力，能区分结构和性质非常相近的其它分子。如蛋 白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体等体系。
由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解 决这一问题，一种有效的分离方法应运而生——亲和层析(Affinity Chromatography，AC)，利用被分离的生命大分子物质和特异性 配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。
生物亲和层析
利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常 具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受 体等。
免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统。广泛 应用于许多以单克隆抗体作为亲和配体的典型蛋白质纯化。 用免 疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于 检测含量低微的样品。
4、亲和层析的分类
特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子 物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸 附特异性强，结合力大。
通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质 （如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高 的吸附容量，但分辨率不及前者。
5、亲和层析的类型
根据配体与生物大分子之间相互作用体系不同，可以把亲和层析分 为：
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有Βιβλιοθήκη 活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。
例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
➢ 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大 分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。
通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合 适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、 偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
主要内容
亲和层析的基本原理 制备方法 操作过程
亲和层析的应用
1、操作流程
层析前：制备亲和层析剂
选择
根据欲分离物质特性
配基
选择
根据配基分子大小及基团特性
载体
偶联 亲和层析剂
3、特点
优点：上样量大，纯化过程简单、迅速，且分离效率 高，被分离物质的活性不易丧失。特别适用于分离纯 化一些含量低、稳定性差的生物大分子。
缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将 其制备成固相载体，在洗脱中，交联在层析介质上的 配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如 抗体、染料等配基。成本相对较昂贵。