亲和层析法

■ 金属螯合层析法：
imidazole
固相载体
C-COபைடு நூலகம்H
-O-C-C-C-O-C-C-C-N
OH
OH C-COOH
His
Ni His
His
Protein
elution
Metal Chelate Affinity Chromatography
Juang RH (2004) ECX
■ 亲和层析法实例的原始材料：
Superxoide dismutase (SOD)
■ 疏水性及反相层析法原理：
HIC (liquid-solid)
C18 = -C18H37
Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid)
Polar solvent
Polar solvent
Non-polar solvent
Elution volume (mL)
50
400
Pharmacia HIC
选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的 难题。 填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相 组合最佳分离纯化工艺
蛋白质工业化分离纯化流程图 合成（发酵，组织培养，多肽合成）提取和浓 缩（匀化，离心，过滤，液-液萃取）预分离 （吸附，沉淀，液—液萃取）精细分离和纯化 （色谱）浓缩（超滤，排阻色谱）无菌过滤 和干燥或结晶）
OO - NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N
O
N-Succinimide 琥珀酰亚胺
- O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - C Epoxy
OH
O
spacer arm
■ 各种亲和性载体及其专一性基团：
Pharmacia
配体
親和性分子
抗体 底物或抑制剂
Protein A Con A刀豆素 Heparin Oligo (dT)
Non-polar area
Polar area Hydrophobic group
Non-polar area
Polar phase
++
+
++ +
++ + ++
Using non-polar groups as a stationary phase Using ion-exchanger
C6 = -C6H13 Phenyl = -C6H6
■ 亲和性载体的反应基团：
CNBr - OH
-O-C N
NH2 - Protein NH
-O-C N
- O - C - NH - Protein CNBr activated
- NH -C-C-C-C-C-C- NH2 Amino
- NH -C-C-C-C-C-C- COOH Carboxylic
羟基磷灰石 (Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法： 利用分子间的疏水性引力 ●液相分配： 分子在两液相间的分配比例不
同
■ 蛋白质表面的极性或非极性分布：
Hydrophobic area
Activie site
Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36
两分子间因构象互补所造成的 吸引力是由范德华力所贡献
(2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction
Kd
=O…H-N-
+
+-
■
Van der Waal interactions
构
型
互 补
A
所
范 德
vdw vdw
产 生
华 键 数
的
目 够
吸
多 就
引
足
力
以 产
：
生 亲
B
和
力
between non-polar surfaces
■ 生化分子的反应基团：
氰 基 -C N
●●●●●
醛 基 -HC=O
●●●
羧 基 -COOH 胺 基 -NH2 ●● 醇 基 -OH 硫醇基 -SH ●
醚 -O-
粒子范围和分离方法的选择
A
B
■ 典型的亲和层析操作：
Protein
pH 2.05
Activity
*
Elution volume
■ 专一性作用力的种类：
I. Conformational Match: II. Interaction Forces:
Van der waals interaction
(1) Hydrogen bond
●
烷 基 -CH3
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
Pharmacia
配体基团
親 和 性 载体
反应基团 反应方式
-NH2
-COOH -OH -SH
CNBr-activated Sepharose 4B CH-Sepharose 4B 或活化型
Epoxy-activated Sepharose 4B AH Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Thiopropyl-Sepharose 4B Activated thio-Sepharose 4B
耦合反应 (3) Coupling Reaction
(1) Solid Matrix
杂质
B
(2)
Specific
B
Binding
Substance (B)
B
洗脱 Elution
(4)
B
B
■ 亲和层析法的作用机理：
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
亲和基团 配体
固相载体
X
(3)
Elution
Cibacron-Blue AMP, ADP 单糖及衍生物
对应的抗原 对应的酶 部分 IgG 糖蛋白 凝血蛋白等
mRNA NAD(P)+ 结合酶 NAD(P)+ 结合酶 Lectin
(还有更多其它亲和配体和载体)
说明
免疫吸附剂，大多自行合成 酶的专一性结合 单株抗体纯化 对 a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性 Heparin Sepharose CL-6B Oligo (dT)-cellulose Blue Sepharose CL-6B 5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B 用来纯化 lectin
-C≡N
直接反应
-COOH
加 EDC*
N-OH-succinimide 直接反应 Oxirane环氧己烷 直接反应
-NH2 oxirane
加 EDC* 直接反应
oxirane
直接反应
-S-S-R -G-S-S-R
DTT 活化 直接反应
* EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl
亲和层析法
●1 原理： 要有一对具有高亲和性的分子 ●2 亲和吸附剂： 有很多亲和性吸附剂可利用 ●3 金属螯合层析法： 利用分子与金属的吸引力
亲和色谱
原理：酶与载体之间的特异性作用。
亲和洗提
酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用 适当的底物特异地洗提。
■ 亲和层析法的四项要素：
配体 Ligand (A)
CH2OH
Chitin
CH2OH
O
O
OH
O OH
O
NH
NH2
O=CH3
CHOM
鸡蛋粘多糖蛋白
Trypsin
■ 以亲和层析法纯化 Trypsin：
CHOM
Chitin
Trypsin
Disc-PAGE
SDS-PAGE
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和层析 操作过程各步骤样品→
A B C=D
■ Hydroxyapatite 吸附剂：
Juang RH (2004) ECX
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Protein concentration
Ethylene glycol (%)
Ammonium sulfate (% sat.) 25 0
BA
20 10
15 20
10 30 5 40
100
200
300