实验 亲和层析纯化IgG教学内容
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告
1. 实验目的
本实验旨在提取、纯化和鉴定人类血浆中的抗体IgG。
2. 实验步骤
1. 血浆样本制备：
- 收集人类血浆样本，并离心去除细胞成分。
2. 抗体IgG的提取：
- 使用亲和层析技术，将血浆样本加入与IgG特异性结合的柱中，洗脱非特异性蛋白质。
3. 抗体IgG的纯化：
- 将柱中特异性结合的IgG洗脱并收集。
4. 抗体IgG的鉴定：
- 使用免疫学技术（如ELISA或免疫印迹），检测提取的IgG 的纯度和特异性。
3. 实验结果
经过上述步骤，实验成功提取和纯化了人类血浆中的抗体IgG。
通过免疫学技术的鉴定，确定提取得到的IgG具有较高的纯度和特
异性。
具体的实验结果表明人类血浆中存在丰富的抗体IgG。
4. 结论
本实验成功地提取、纯化和鉴定了人类血浆中的抗体IgG。
这
对于进一步研究和应用抗体在医学和生物学领域具有重要意义。
5. 讨论和展望
本实验采用了亲和层析技术和免疫学技术，成功实现了对人类
血浆中抗体IgG的提取、纯化和鉴定。
然而，未来的研究可以探索
更有效的提取和纯化方法，以及进一步验证抗体的功能和应用，扩
展该实验研究的深度和广度。
参考文献
[1] 张三, 李四. 血浆抗体IgG的提取与纯化[J]. 实验生物学杂志, 20XX, XX(X): 123-456.。
纯化抗体IgG使用说明
纯化抗体IgG使用说明
Purification Antibody
规格：1mg/5mg/10mg
保存-20℃保存，有效期一年以上
产品说明:
纯化抗体IgG采用Protein A/G亲和层析纯化，制成高纯度（﹥95%）和高活性的纯化羊或兔IgG抗体。
纯化抗体IgG为PBS溶液，可根据用户要求，配成不同浓度，用前最好-20℃存放，可根据使用方法采用不同浓度稀释。
通常不同使用目的可分别用下列缓冲液稀释，注意完全溶解后充分混匀。
冻存过久会产生少量聚合体，用前最好低温高速离心，去除冷聚合球蛋白及变性蛋白后重新定量。
抗体标记：500ug～20mg/ml，ELISA包板：10～20ug/ml，层析金条对照线：2mg/ml等。
胶体金标记：用pH9.0硼酸缓冲液稀释。
HRP标记：用0.01mol/L pH9.0CB或用包被液CB稀释。
荧光素标记：用0.5mol/L pH9.5CB（碳酸盐缓冲液）稀释。
生物素标记：用0.1mol/L NaHCO3稀释。
其它方法：如免疫扩散可用0.01mol/L pH7.2PBS稀释。
浓度：
一般情况10mg/ml，具体信息见标签。
相关试剂：
SP034兔IgG免疫球蛋白抗原
SA134羊抗兔IgG(免疫血清)
SF134羊抗兔IgG-FITC
SE237兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
实验 亲和层析纯化IgG PPT课件
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
IgG的分离
3. DEAE纤维素离子交换层析步骤
(1) 装柱：取层析柱固定于支架上，关紧下端出口， 将处理好的DEAE纤维素搅拌后均匀装入柱内，柱 高约10cm；
(2) 平衡：打开下端出口， 0.0175M pbs (pH6.3) 平衡， 使DEAE纤维素分布均匀后关闭下端出口；
• DEAE-纤维素层析 (磺柳酸试剂检查蛋白质）（样C）
A、B、C样品 • 醋酸纤维薄膜电泳（鉴定γ-球蛋白的纯度）
1. 盐析实验操作步骤
留取血清2滴电泳用(A液). (1) 取血清2ml+生理盐水2ml ， (2) 取4ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。
饱和度33%-50%时，球蛋白析出；饱和度大于50%时，白蛋白析出。
固定相中溶质浓度 K= 流动相中溶质的浓度
K与溶质和溶剂的性质有关
固定相：多孔性固体支持物（滤纸、硅藻土、纤维 素等）吸附一种溶剂。 流动相：与固定相溶剂不溶的溶剂。
• 离子交换层析
是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的 的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不 溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离 子或阴离子进行可逆的交换。
阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离 子，与样品溶液中的阴离子进行交换。
强碱型阴离子交换剂：季胺 [R-N+(CH3)3-OH-]
弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N+HH2-OH-)
仲胺 (R-N+HCH3H-OH-)
基架
+ +
OHOH-
叔胺 活性基团
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
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四、实验步骤
1. Protein A纯化：
1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取 20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止 水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料 中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上 层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内 洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶 柱应符合无气泡、无节痕、床面平正。
+ +/-
+ 相对结合强度 – 弱或不结合
蛋白 G 结合 ++++
++++ ++++ +++ +++ +++ +++
+ ++++ ++ ++ ++
三、实验材料——纯化
试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二 钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙 醇；均为分析纯。 容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管 5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个 填料：Protein A 层析柱：XK10或预充柱 装柱体积：~2ml 血清：~2ml 滤器： 0.45μm针头式滤器5个； SDS-PAGE:
蛋白 G 结合
-
++++ ++++ ++++ ++++ -
++++ + ++
++ ++ ++ ++++ + +
种属
恒河猴 大鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM* 猪 兔 小鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 绵羊
蛋白 A 结合 ++++
+ ++++ +++ ++ 可变的 +++ ++++
二、实验原理蛋白 A 和 蛋白 G 的结合特异性
种属
人
IgA IgD IgE IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM* 鸟类蛋黄 IgY† 牛 狗 山羊 豚鼠
IgG1 IgG2 仓鼠 马 考拉 骆驼
蛋白 A 结合
可变的 -
++++ ++++ ++++ 可变的
++ ++ -
++++ ++++ + ++ -
标记为S.
三、实验材料——SDS-PAGE
试剂：
1. 2x样品缓冲液
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加 蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存 ，临用前稀释10倍（减半配制）。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于 200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到 250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
实验 亲和层析纯化IgG
实验（三）血清中抗体纯化（16学时）
二、实验原理
抗体纯化配基类型
配基
族特异性 专一特异性
Protein A Protein G Antigen Anti-IgG
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
二、实验原理
低 pH下洗脱
2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验ห้องสมุดไป่ตู้骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
三、实验材料——纯化
缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，
pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)
稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。
器材：
电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
三、实验试剂——浓度测定
考马斯亮蓝G-250蛋白染色液 (1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏 水，定容到100ml. (2) 考马斯亮蓝G-250试剂
取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙 醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容 到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
分离胶及浓缩胶的制备：
1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净， 用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照 说明书提示装好玻璃板；
用 rProtein A Sepharose™ 分离IgG Column: HiTrap™ Protein A FF 结合缓冲液: 20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3 注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收 集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中