生物分离工程第四章-沉淀分离法
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9沉淀法-生物分离工程
(1)盐析
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。
盐析是可逆的，而变性是不可逆的
盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集。 （2）中和电荷，减少静电斥力。
PH＜PI，带正电荷， 又有水膜，是稳定的 亲水胶体
在等电点状态的 酶蛋白，水膜未脱， 是不稳定的亲水胶体
阴离子盐析效果 ：
柠檬酸根＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子
盐析用盐的选择
常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 （1）价廉 ； （2）溶解度大，温度系数小； （3）不易引起蛋白质变性。
2-
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蛋白质沉淀
盐析机理示意图
盐析过程
（1）“盐溶”—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度下降
A.中和蛋白质表面电荷；
B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水
区暴露；
盐析用盐的选择
规律：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的 低价离子作用较弱
(2)等电点沉淀法
1.0
调pH至等电点，蛋白质 所带净电荷为零，降低 了静电斥力，而疏水力 能使分子间相互吸引， 形成沉淀的操作称为等 电点沉淀
未沉淀蛋白质的分率
0.8 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 对大豆蛋白质 溶解度的影响
等电点沉淀法注意事项
适用于憎水性较强的蛋白质； 往往不能获得高的回收率； 在调节等电点时，防止酶的失活或蛋白变性。
生物分离工程-沉淀法
Ca2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+等离子，在相同的情况下 这些金属离子对茶多酚沉淀的顺序是Se2+ > Al3+ > Zn2+ > Fe3+ > Mg2+ > Ba2+ > Ca2+
3 应用实例
金属离子沉淀茶多酚 优点：(1)产品纯度高；(2)减少了大量有机萃取剂的
使用，减少一定量的能耗；(3)工艺流程上来看，包 含了有机溶剂以及沉淀剂的回收利用，工艺简单易 实现，沉淀剂等辅料成本较低。
沉淀法
沉淀
1 概述 2 盐析法 3 等电点沉淀法 4 有机溶剂沉淀法 5 非离子型聚合物沉淀法 6 聚电解质沉淀法 7 金属离子沉淀法
1 概述
沉淀法特点：Байду номын сангаас
成本低，收率高，浓缩倍数高 作为纯化前处理或最后产物 收集方法 操作简便
2 盐析法
盐析法是在蛋白质溶液中加入无机盐至一定浓度，
或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从 而与水溶性大的杂质分离。
3 应用实例
金属离子沉淀精制磷脂酰胆碱
3 应用实例
金属离子沉淀精制磷脂酰胆碱
7 金属离子沉淀法
优点是其在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀 能力。
分为三类：
Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+能和羧酸，含 氮化合物如胺以及杂环化合物相结合；
3 应用实例
金属离子沉淀茶多酚 金属离子可以与茶多酚形成络合物沉淀，茶叶中其
他的物质则不能，将沉淀物从溶剂中分离出并在酸 的作用下进行转溶，即可得到原来的茶多酚。金属 离子沉淀法是在浸提基础之上采用沉淀一转溶将茶 多酚从浸提液中分离纯化出的一种方法。
3 应用实例
金属离子沉淀茶多酚 优点：(1)产品纯度高；(2)减少了大量有机萃取剂的
使用，减少一定量的能耗；(3)工艺流程上来看，包 含了有机溶剂以及沉淀剂的回收利用，工艺简单易 实现，沉淀剂等辅料成本较低。
沉淀法
沉淀
1 概述 2 盐析法 3 等电点沉淀法 4 有机溶剂沉淀法 5 非离子型聚合物沉淀法 6 聚电解质沉淀法 7 金属离子沉淀法
1 概述
沉淀法特点：Байду номын сангаас
成本低，收率高，浓缩倍数高 作为纯化前处理或最后产物 收集方法 操作简便
2 盐析法
盐析法是在蛋白质溶液中加入无机盐至一定浓度，
或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从 而与水溶性大的杂质分离。
3 应用实例
金属离子沉淀精制磷脂酰胆碱
3 应用实例
金属离子沉淀精制磷脂酰胆碱
7 金属离子沉淀法
优点是其在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀 能力。
分为三类：
Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+能和羧酸，含 氮化合物如胺以及杂环化合物相结合；
3 应用实例
金属离子沉淀茶多酚 金属离子可以与茶多酚形成络合物沉淀，茶叶中其
他的物质则不能，将沉淀物从溶剂中分离出并在酸 的作用下进行转溶，即可得到原来的茶多酚。金属 离子沉淀法是在浸提基础之上采用沉淀一转溶将茶 多酚从浸提液中分离纯化出的一种方法。
《沉淀分离法》课件
03
分析实验结果的影响因 素，如沉淀剂的种类和 浓度、溶液的pH值、温 度等。
04
比较不同实验条件下的 分离效果，总结沉淀分 离法的优缺点和应用范 围。
沉淀分离法的应用
06
实例
在污水处理中的应用
总结词
沉淀分离法在污水处理中应用广泛，能有效去除污水中的 悬浮物和重金属离子。
详细描述
通过向污水中投加化学药剂，使水中不易溶于水的悬浮物 或重金属离子形成沉淀物，再通过固液分离技术将沉淀物 从水中分离出来，达到净化水质的目的。
5. 倾倒上清液
小心倾倒掉上清液，收集沉淀 物。
6. 洗涤和干燥
对沉淀物进行洗涤和干燥，得 到纯净的目标物质。
7. 结果分析
对实验结果进行分析，计算目 标物质的回收率和纯度。
实验结果与讨论
01
记录实验过程中观察到 的现象，如沉淀物的生 成、颜色的变化等。
02
对实验结果进行定量分 析，计算目标物质的回 收率和纯度。
历史与发展
历史
沉淀分离法最早可追溯到19世纪初 期，随着科学技术的不断发展，沉淀 分离法也在不断改进和完善。
发展
现代沉淀分离法已经发展出了多种分 离技术，如共沉淀、均相沉淀、盐析 等，广泛应用于化学、生物、医学等 领域。
应用领域
化学分析
用于分离和富集痕量元 素或复杂样品中的组分
。
生物制药
用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
沉淀溶解损失
在洗涤和转移过程中，部 分沉淀可能会溶解，导致 产物的损失。
改进方向
优化沉淀剂的选择
通过选择合适的沉淀剂，可以改善沉 淀的生成和过滤性能。
改进洗涤方法
减少沉淀溶解损失
生物分离工程4沉淀.ppt.Convertor
稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 有机溶剂的选择 V=V0[(S2-S1)/(100-S2)]
V：所需100%浓度的有机溶剂体积 V0 ：需沉淀的原溶液体积 S1 ：原溶液中有机溶剂的浓度 S2 ：要求达到的有机溶剂浓度 缺点 容易引起蛋白质变性失活
后产物 收集方法 (3) 操作简便 蛋白质的溶解特性 蛋白质胶体溶液的稳定性 静电斥力 吸引力 盐析(Salt induced precipitation) 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中 的溶解度降低，产生沉淀的过程。 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子 间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质 周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞 蛋白质盐析 机理： （1）破坏水化膜， （2）中和电荷 盐析经验式
与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。 分离核酸用沉析剂 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液 中。 选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差 异，实现分离。 加入变性剂 选择性热变性 选择性酸碱变性
盐溶 盐析 饱和度 中性盐的盐析效果 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的 电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区 的相互作用导致沉淀 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式
V：所需100%浓度的有机溶剂体积 V0 ：需沉淀的原溶液体积 S1 ：原溶液中有机溶剂的浓度 S2 ：要求达到的有机溶剂浓度 缺点 容易引起蛋白质变性失活
后产物 收集方法 (3) 操作简便 蛋白质的溶解特性 蛋白质胶体溶液的稳定性 静电斥力 吸引力 盐析(Salt induced precipitation) 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中 的溶解度降低，产生沉淀的过程。 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子 间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质 周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞 蛋白质盐析 机理： （1）破坏水化膜， （2）中和电荷 盐析经验式
与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。 分离核酸用沉析剂 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液 中。 选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差 异，实现分离。 加入变性剂 选择性热变性 选择性酸碱变性
盐溶 盐析 饱和度 中性盐的盐析效果 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的 电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区 的相互作用导致沉淀 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式
生物分离工程4沉淀法
第四章沉淀法在分离制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。
沉淀：流体中分散悬浮的固体或液体，在重力、离心力、静电力等各种力场内，将粒子互相或自流体分离的作业。
例：澄清(clarification)、稠化(thickening)、类析(classification)、浮选(floatation)、重液分离(heavy liquid separation)、集尘(dust collection)。
其中使用离心力场的特称为离心分离。
一、沉淀的类型沉淀按其物理性质不同，可粗略分成两类：晶形沉淀和无定形沉淀 ( 又称非晶形沉淀或胶状沉淀 ) 。
晶形沉淀如：BaSO4，MgNH4PO4， CaC2O4·2H2O ， PbSO4其颗粒直径约0.1 ～ 1 μ m 。
非晶形沉淀： Fe2O3·nH2O ， ZnS ，Al2O3·nH2O[Al(OH)3] 其颗粒直径一般 <0.02 μ m 。
晶形沉淀：内部排列较规则，结构紧密，整个沉淀所占体积较小，易沉降于容器底部。
无定形沉淀，由许多疏松聚集在一起的微小沉淀颗粒组成，排列杂乱无章，有时又包含大量数目的 H2O ，所以是疏松的絮状沉淀。
介于晶形沉淀与无定形沉淀之间的为凝乳状沉淀，颗粒大小 0.1>d>0.02 μ m ，如 AgCl 。
二、沉淀的形成沉淀的形成一般经过晶核形成和晶核长大两个过程。
将沉淀剂加入试液中，当形成沉淀的离子浓度乘积大于其 KSP ，离子通过静电引力结合成一定数目的离子群，即为晶核。
晶核形成后，构晶离子向晶核表面沉积，晶核就逐渐长大成微粒。
聚集速度 V ：由离子聚集成晶核，再进一步积集成沉淀颗粒的速度。
定向速度 V ′：在聚集的同时，构晶离子又按一定晶格排列，这种定向排列速度。
若聚集速度 V 大，而定向排列速度 V ′小，即离子很快聚集来生成沉淀微粒，却来不及进行晶格排列，则得到的是非晶形沉淀。
生物工程下游技术 第四章 沉淀法
第四章 沉淀法
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有 以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中 各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存 在的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有 以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中 各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存 在的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
生物分离工程第四章沉淀分离法
3. 分类 – 与羧基、胺及杂环等含氮化合物结合；如Mn2+、Fe2 + 、Zn2 + 、 Cu2 +等 – 与羧基结合，不与胺及杂环等含氮化合物结合；如Ca2 + 、Ba2 + 、 Mg2 + 、Pb2 +等 – 与巯基结合；如Hg + 、Ag + 、Pb2 +等
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
生物分离工程期末复习资料
第一章1．生物分离工程的一般过程P4答：①发酵液的预处理主要采用凝聚和絮凝等技术来加速固相，液相分离，提高过滤速度。
过滤、离心是其最基本的单元操作。
②产物的提取采用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作。
③产物的精制常采用色谱分离技术，有层析、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱。
④成品的加工处理浓缩、结晶、干燥第二章一、概念：1.发酵液的预处理：指采用凝聚和絮凝等技术来加速固相、液相分离，提高过滤速度。
2.凝集（凝聚）：指在投加的化学物质（如水解的凝聚剂，铝、铁的盐类或石灰等）作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为1mm大小块状絮凝体的过程。
3.絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。
4.离心分离：指在离心场的作用下，将悬浮液中的固相和液相加以分离的方法。
主要用于颗粒较细的悬浮液和乳浊液的分离。
（分为差示离心、均匀介质离心、密度梯度离心、等密度梯度离心和平衡等密度离心。
）5.等电点沉淀法：利用蛋白质等两性化合物在等电点时溶解度最低，易产生沉淀的性质，用酸化剂或碱化剂调节发酵液的pH，使其达到菌体蛋白的等电点而产生沉淀。
二、填空：1、按过滤时料液流动方向的不同，分为常规过滤和错流过滤。
2、可溶性杂蛋白的去除法包括：等电点沉淀法、热处理法、化学变性沉淀法和吸附法三、问答1、发酵液的一般特征？①组成大部分为水；②发酵产物的浓度较低；③发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋白的胶状物；④含有培养基中的残留成分，如无机盐类、非蛋白质大分子及其降解产物；⑤含有其他少量代谢副产物；⑥含有色素、毒性物质。
热原质等有机杂质。
2、常用的絮凝剂有什么？无极絮凝剂：Al2(SO4)3·18H2O (明矾)、氯化钙、氯化镁碱式氯化铝、高分子无机聚合物等。
有机絮凝剂：壳多糖及其衍生物、明胶、丙烯酰胺类、聚苯乙烯类、聚丙烯酰类聚乙烯亚胺类。
3、影响絮凝效果的因素？答：①絮凝剂的种类；②絮凝剂浓度；③ pH; 最关键因素，影响絮凝剂活性基团的解离度。
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• β—截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白
质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0)
• Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋
白质和无机盐的种类有关。
经验方程的图示
盐析法分为两种类型
1. 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离 子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析法。
3.盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种 情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度 增大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度 随之下降，原因如下：
A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对， 部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
二、沉淀分离法
（一）概述
1. 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而
形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系
在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在 化学反应的沉淀或结晶。
区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子 或离子以无规排列形式析出。
2、类型
1) 盐析沉淀法 2) 有机溶剂沉淀法 3) 等电点沉淀法 4) 高分子聚合物沉淀法 5) 金属离子沉淀法
（Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度） 2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，
达到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度）
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共 沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般粗 提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常用 第2种方法。
➢ 而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有 一些发酵液则不行。
问题
固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？
项目 离心法
过滤法
浓缩物
悬浮液或 浆体 滤饼
设备
需 专用设备
不需 专用设备
经济 适用性 成本高
成本低
处理量 小
应用 范围
（二）盐析沉淀法
1. 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的
溶解度降低而产生沉淀的过程
2.盐析原理
首先需要了解蛋白质的特性：
是高分子两性电解质，主要由 疏水性不同的氨基酸组成，蛋 白质表面由不均匀分布的荷电 基团形成荷电区、亲水区和疏 水区构成。大部分蛋白质溶于 水，是以亲水胶体的形式或大 分子溶液存在的。
沉淀法的优点：
设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在 产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；
沉淀法的缺点：
所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类， 或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法 低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例 子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生 产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之 间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和 基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。
第四章 离心和沉淀分离法
大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发 酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变 化范围很宽。
➢ 浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低 至每单位体积仅含0.1%。
➢ 粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为 1mm的不溶性物质。
对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物， 我们可以采用过滤方法分离。
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
沉淀分离的目的：
（1）通过沉淀使目标成分浓缩和去除杂质； （2）通过沉淀将已经纯化的产物由液态变为固态，便于 保存和进一步加工。
沉淀法用于分离纯化应该是是有选择性的，即有选择地沉 淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
沉淀法操作步骤
• 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； • 沉淀物的陈化，促进晶体生长； • 离心或过滤，收集沉淀物；
4、盐析剂的选择
1) 盐析剂的条件
➢ 盐析作用要强：
盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子
➢ 有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。
➢ 盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引 入不易分离的杂质。
B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水 区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
离子强度对盐析过程的影响
• 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式）
loSgKsI
β，Ks—常数
• S—蛋白质溶解度，mol/L;
• I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价
I 1
2
ciZi2
β和Ks的物理意义
实验室范围
大
实验室
工业范围
离心力：
离心分离原理
Stock’s Force(粘滞吃力)：
离心沉降速度：
分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值
意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心 机的分类
离心技术分类
按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr < 3,000g 三足沉降式: 500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g 2)、中速离心机，Fr = 3,000 — 5,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 3)、高速离心机，Fr = 5,000 — 20,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 管式离心机：>8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 — 1,000,000g
蛋白质溶液的稳定性
➢电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间 相互排斥，形成稳定的分散系
➢空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞，形成稳定的胶体溶液。
可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚 度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。
盐析示意图
破坏水化层 中和电荷
质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0)
• Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋
白质和无机盐的种类有关。
经验方程的图示
盐析法分为两种类型
1. 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离 子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析法。
3.盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种 情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度 增大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度 随之下降，原因如下：
A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对， 部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
二、沉淀分离法
（一）概述
1. 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而
形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系
在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在 化学反应的沉淀或结晶。
区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子 或离子以无规排列形式析出。
2、类型
1) 盐析沉淀法 2) 有机溶剂沉淀法 3) 等电点沉淀法 4) 高分子聚合物沉淀法 5) 金属离子沉淀法
（Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度） 2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，
达到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度）
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共 沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般粗 提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常用 第2种方法。
➢ 而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有 一些发酵液则不行。
问题
固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？
项目 离心法
过滤法
浓缩物
悬浮液或 浆体 滤饼
设备
需 专用设备
不需 专用设备
经济 适用性 成本高
成本低
处理量 小
应用 范围
（二）盐析沉淀法
1. 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的
溶解度降低而产生沉淀的过程
2.盐析原理
首先需要了解蛋白质的特性：
是高分子两性电解质，主要由 疏水性不同的氨基酸组成，蛋 白质表面由不均匀分布的荷电 基团形成荷电区、亲水区和疏 水区构成。大部分蛋白质溶于 水，是以亲水胶体的形式或大 分子溶液存在的。
沉淀法的优点：
设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在 产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；
沉淀法的缺点：
所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类， 或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法 低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例 子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生 产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之 间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和 基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。
第四章 离心和沉淀分离法
大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发 酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变 化范围很宽。
➢ 浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低 至每单位体积仅含0.1%。
➢ 粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为 1mm的不溶性物质。
对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物， 我们可以采用过滤方法分离。
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
沉淀分离的目的：
（1）通过沉淀使目标成分浓缩和去除杂质； （2）通过沉淀将已经纯化的产物由液态变为固态，便于 保存和进一步加工。
沉淀法用于分离纯化应该是是有选择性的，即有选择地沉 淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
沉淀法操作步骤
• 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； • 沉淀物的陈化，促进晶体生长； • 离心或过滤，收集沉淀物；
4、盐析剂的选择
1) 盐析剂的条件
➢ 盐析作用要强：
盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子
➢ 有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。
➢ 盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引 入不易分离的杂质。
B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水 区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
离子强度对盐析过程的影响
• 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式）
loSgKsI
β，Ks—常数
• S—蛋白质溶解度，mol/L;
• I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价
I 1
2
ciZi2
β和Ks的物理意义
实验室范围
大
实验室
工业范围
离心力：
离心分离原理
Stock’s Force(粘滞吃力)：
离心沉降速度：
分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值
意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心 机的分类
离心技术分类
按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr < 3,000g 三足沉降式: 500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g 2)、中速离心机，Fr = 3,000 — 5,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 3)、高速离心机，Fr = 5,000 — 20,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 管式离心机：>8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 — 1,000,000g
蛋白质溶液的稳定性
➢电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间 相互排斥，形成稳定的分散系
➢空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞，形成稳定的胶体溶液。
可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚 度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。
盐析示意图
破坏水化层 中和电荷