基于酪胺信号放大的新型免疫传感器
酪胺信号放大技术原理
酪胺信号放大技术原理
酪胺信号放大技术是一种通过增强酪胺化合物的信号强度来提高检测灵敏度和准确性的技术。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 酪胺化合物的产生：在样品中含有的酪胺化合物（如去甲肾上腺素、多巴胺等）与特定的酶或氧化剂反应，生成氧化酪胺化合物（如肾上腺素醌、多巴醌等）。
2. 信号放大试剂的添加：将信号放大试剂加入样品中，该试剂可与氧化酪胺化合物反应，生成可发生电化学或光学检测的产物。
这个步骤主要通过增加物质的浓度，进一步放大酪胺信号。
3. 信号检测：根据所选择的检测方法，对信号放大后的样品进行检测。
常用的检测方法包括电化学方法（如循环伏安法、差分脉动伏安法等）和光学方法（如荧光检测、吸光度测定等）。
检测结果可通过分析仪器转化为定量的信号。
通过酪胺信号放大技术，可以提高酪胺化合物的检测灵敏度和准确性。
这对于许多领域的应用很有意义，如药物研发、医学诊断和神经科学研究等。
酪胺信号放大(TSA)技术-免疫组织化学IHC和荧光原位杂交FISH
试剂盒保存：试剂盒中所有试剂均需4度保存，请在6个月内使用完。
其中，FITC-tyramide、Catalyzer需避光保存，Blocker可分装-20度保存，避免反复冻融。
试剂盒使用须知：本试剂盒针对⽯蜡切片免疫荧光优化。
同时也适用于冰冻切片免疫荧光和铺片细胞免疫荧光。
对于冰冻切片免疫荧光，在切片⽔化，固定后从本试剂盒操作说明第4步加Blocker开始操作。
⽽对于铺片细胞免疫荧光，则在固定，通透后从本试剂盒操作说明第四步加Blocker开始操作。
与传统使用荧光基团偶联⼆抗的显⾊⽅法相比，使用我们的显⾊系统可以将免疫荧光检测的灵敏性提⾼100倍以上，能显著地提⾼信噪比。
使用本试剂盒操作时，Catalyzer和FITC-tyramide的使用均需新鲜配制。
使用本试剂盒，需自备以下试剂：PBSTx：PBS加0.3%的TritonX-100柠檬酸钠缓冲液（10mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20， pH 6.0）：Trisodium citrate dihydrate 2.94g加双蒸⽔到1000 ml混匀⾄溶解，使用盐酸将pH调制6.0加⼊0.5 ml的Tween 20，混匀。
可4度长期保存。
操作步骤：1、⽯蜡切片脱蜡⾄⽔：（⽯蜡切片脱蜡前应置于60度30分钟）⼆甲苯I、II，各洗3分钟；⼆甲苯与酒精1：1、洗3分钟。
梯度酒精：100%I，3分钟；100%II，3分钟；95%，3分钟；70%，3分钟；50%，3分钟。
自来⽔洗5分钟。
2、抗原修复：将0.1M柠檬酸盐缓冲液（PH=0.6），用微波炉加热⾄沸腾，将脱完蜡及复⽔好的片⼦置于缓冲液中，持续煮沸20分钟。
注意此过程中，玻片上组织要⼀直浸没于缓冲液中，以保证组织的抗原修复效果。
20分钟后，将玻片立即放⼊自来⽔中10分钟。
主要不要烫伤。
为了节省试剂，使用疏⽔笔将组织圈出，后续的加样与液体置换操作对象为疏⽔圈，加样体积每张玻片100-200ul。
酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法的建立
［ ｓ ａ ｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏ ｅｔ ｌｈ ａ ｎｖｌｍｅ ｏ ｏ Ｎ ｃｏｒ ｙ ｏ ｖ ｕｌｄ ｔ ｔ ｎ ｂ ｓｄ ｏ ｙａ ｉｃ Ａｂｔ ｃ］ ｒ ｊｃｉ ：Ｔ ｓ ｂｉ ｏｅ ｖ ａ ｓ ｔ ｄ ｆ Ｄ Ａ ｍｉ ａｒ ｆ ｉ ａ ｅ ｃｉ ａｅ ｎ ｔｒｍ ｎ ｈ ｒ ｒ ａ ｓ ｅ ｏ
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［ 要 ］ 目的 ： 立 一 种 酪 胺 信 号 放 大 一 子 点标 记 银 染 增 强 的 基 因芯 片 可视 化 检 测 方 法 ， 高 基 因 芯 片 检 测 的 灵 摘 建 量 提 敏 度 。 方 法 ： 测 靶 基 因 与 固定 在 玻 片上 的探 针 杂 交 ， 次 加入 链 霉 亲和 素标 记 的辣 根 过 氧 化 物 酶 、 物 素标 记 的酪 待 依 生
纳米技术在生物传感器及检测中的应用
究成果 。最后 ,对该领域的应用前景进行了展望 。
关键词 :纳米技术 ;纳米生物学技术 ;纳米颗粒 ;纳米生物传感器 ;生物检测
中图分类号 :TP212. 3
文献标识码 :A 文章编号 :100421699( 2006) 0320581207
纳米技术是在 1～100 nm 尺度上研究物质的 结构和性质的多学科交叉的前沿技术 。1959 年 ,美 国物理学家 Richard 首次提出了在纳米空间操纵物 质的概念 。Drexler 将纳米技术定义为“分子制造的 产品和过程 ,即操纵分子并进行分子装配所形成的 产物及其控制过程”[1] 。纳米生物技术是用于研究 生命现象的纳米技术 ,是纳米技术和生物技术的结 合 ,它是在分子水平上 ,结合物理 ,化学和遗传规律 对生物材料进行加工 ,其最终目的是组装成一系列
Abstract :Nano biotechnology is co nverged by nanotechnology and biotechnology , and is a majo r co mpo nent of nanotechnology. It is al so an impo rtant research topic in t he area of bio medicine. The nanoparticle is t he mo st interested and usef ul nano material used in t he bio medical field , which have many characteristics. This article int ro duced so me new reserach achievement s and p rogress in t he bio sensor and biodetectio n field based o n t he nanoparticle technology , p resented t he synt hesis met ho ds for nanoparticle , t he applicatio n of nanoparticle in t he nano bio sensor and nano biochip , and so me related research work carried o ut in o ur lab. Finally , t he develop ment of t his field in t he f ut ure was p ro spected. Key words :nanotechnology ; nano biotechnology ; nanoparticle ; nano bio sensor ; bio detectio n EEACC :7230J
酪酰胺信号放大原理
酪酰胺信号放大原理酪酰胺信号放大原理是一种用于增强信号强度的技术，广泛应用于生物医学领域的研究和临床诊断中。
这种技术的原理基于酪酰胺信号的放大效应，通过一系列的反应步骤，将微弱的酪酰胺信号转化为强烈的信号，从而提高对目标物质的检测灵敏度。
酪酰胺是一种含有酰胺基团的有机化合物，在生物体内广泛存在。
在研究和诊断中，人们常常需要检测酪酰胺的含量来判断某种生物过程的发生与否，或者评估某种疾病的严重程度。
然而，由于酪酰胺信号的弱小，常常需要进行信号放大处理，以提高检测的准确性和可靠性。
酪酰胺信号放大的原理可以简单概括为以下几个步骤。
第一步，前处理。
对于复杂的生物样本，常常需要进行前处理步骤，以去除干扰物质，减少信号的背景噪音。
前处理步骤可以包括样本的提纯、浓缩、稀释等操作，以确保待检测的酪酰胺信号能够更加纯净地进入下一步骤。
第二步，酪酰胺信号的扩增。
在这一步骤中，使用一种特定的放大系统，例如酶的催化反应、酶标记等，将酪酰胺信号扩大数倍甚至数十倍以上。
这种放大系统可以将酪酰胺与一种底物结合，通过一系列的反应步骤，使底物的浓度成倍增加，并且与酪酰胺形成稳定的复合物。
这样一来，酪酰胺信号的强度也会相应增加。
第三步，信号的检测。
在酪酰胺信号放大的过程中，往往会引入一种标记物，用于标记酪酰胺的位置和数量。
通过对标记物的检测，可以间接地确定酪酰胺的存在和含量。
常用的标记物有荧光染料、放射性同位素、酶等。
这些标记物具有高灵敏度和高特异性，可以准确地检测到放大后的酪酰胺信号。
酪酰胺信号放大原理的应用广泛，涵盖了生物医学领域的多个方面。
例如，在癌症的早期诊断中，人们可以通过放大酪酰胺信号，检测微量的肿瘤标志物，从而实现早期发现和治疗。
在药物研发中，酪酰胺信号放大可以用于评估药物的代谢和药效，以指导药物的合理使用和剂量调整。
此外，该技术还可以应用于基因检测、蛋白质分析、细胞信号传导等领域。
酪酰胺信号放大原理是一种有效的信号增强技术，通过一系列的反应步骤，将微弱的酪酰胺信号放大，以提高信号的强度和可检测性。
APTASensor在生物分析中的应用
APTASensor在生物分析中的应用生物分析是一项非常重要的科学研究，它涉及到生命基础科学研究、医学临床和药物研发等众多领域。
随着科技的不断进步，越来越多的新技术被应用于生物分析中，其中之一就是APTASensor技术。
APTASensor技术是一种新型的生物传感器，它能够检测并定量分析生物分子，如DNA、RNA、蛋白质等，还可以用于生物体内的监测和诊断。
这项技术具有高灵敏度、高选择性、高稳定性等特点，因此在生物分析领域中具有广泛的应用前景。
一、 APTASensor技术的原理APTASensor技术是基于核酸适体的一种传感技术。
核酸适体是一种通过离子诱导的亲和力进化技术获得的高度亲和的寡核苷酸序列，类似于抗体。
适体具有特异性、稳定性和可再现性，并且可以通过化学修饰或标记来实现操纵和检测。
APTASensor技术中，适体被修饰成电极表面上的生物识别元件，用于检测靶分子的存在和特定浓度。
当靶分子结合到适体上时，它会改变电极表面的电学信号，例如电流、电势或电容等。
通过检测电学信号的变化，可以确定靶分子的存在和浓度。
APTASensor技术具有高灵敏度和高选择性的特点，因为适体具有极高的亲和力，并且可以针对具有不同结构和功能的蛋白质进行选择性的进化，从而实现高选择性的检测。
此外，APTASensor技术还具有实时检测和无需标记的特点，可以实现高效、高速和无损检测。
二、 APTASensor技术的应用APTASensor技术在生物分析领域中有许多应用，如生物传感、生物成像、药物筛选等。
1. 生物传感：APTASensor技术可以用于检测患者血液中的某些生物分子，如病毒、细胞因子、肿瘤标志物等。
这些生物分子是某些疾病的指标，可以通过适配体和电化学传感器进行定量检测。
在临床诊断中，APTASensor技术可以用于疾病的早期预测和诊断、助剂治疗及疾病的追踪等方面。
2. 生物成像：APTASensor技术可以用于细胞成像、组织成像和动物成像等方面。
L-酪氨酸分子印迹传感器敏感膜的制备与性能研究
L-酪氨酸分子印迹传感器敏感膜的制备与性能研究申贵隽;熊迪【期刊名称】《大连大学学报》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】以邻苯二胺（o-PD）为功能单体，采用电化学聚合的方法，在金电极表面电聚合成分子印迹聚合物膜。
洗脱模板分子，优化制备过程的条件，获得了 L-酪氨酸（L-Tyrosine）分子印迹传感器敏感膜。
并通过循环伏安法（CV)、示差脉冲伏安法（DPV)和电化学阻抗谱法（EIS）三种方法考察了电极的性能；在循环伏安法（CV）方法测试结果表明，模板分子 L-酪氨酸在磷酸缓冲溶液（PH=8.0）中与功能单体邻苯二胺能聚合并吸附在金电极表面，并且在聚合前后及洗脱模板分子前后峰电流有明显差异；由示差脉冲法（DPV）测试结果表明，在(1×10-2~2.0) mg/mL 范围内，峰电流与 L-酪氨酸的浓度成线性关系，检出为2.0mg/mL。
选择识别性实验结果表明，该分子印迹修饰电极对与 L-酪氨酸相似的 L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸的电流响应很小，说明分子印迹传感膜对 L-酪氨酸有特异性识别功能；EIS 方法测试表明，印迹电极对 L-酪氨酸分子具有识别作用。
%L-Tyrosine as template molecule, o-phenylendiamine as functional monomer, on the gold electrode surface sensitive in situ synthesized molecularly imprinted polymer membranes. By cyclic voltammetry(CV), differential pulse voltammetry(DPV) and electrochemical impedance spectroscopy(EIS) to investigate the performance of the electrode. CV method tests show that the template molecules L-tyrosine in phosphate buffer solution (PH=8.0) o-PD and functional monomers topolymerization and adsorption on the gold electrode surface, and before and after polymerization and elution peak current have obvious difference before and after the template molecules. DPV test results show that in1×10-2~2.0 mg/mL range, the peak current and a linear relationship with the concentration of L-tyrosine, the detection limit of 2.0 mg/mL. Chooseing the recognition experiment results show that the molecularly imprinted modified electrodes are similar to L-tyrosine L-phenylalanine, L-alanine, L-tryptophan, the current response of L-aspartate is very small, that molecularly imprinted sensor membrane have specific recognition of L-tyrosine.EIS method test showed that the imprinted electrode for L-tyrosine molecular recognition.【总页数】5页(P53-57)【作者】申贵隽;熊迪【作者单位】大连大学环境与化学工程学院，辽宁大连 116622;大连大学环境与化学工程学院，辽宁大连 116622【正文语种】中文【中图分类】TB383.2【相关文献】1.L-酪氨酸印迹聚合物的本体聚合法制备及性能 [J], 王锦;谢迟;董新荣;雷孝2.L-色氨酸分子印迹传感器敏感膜的制备与性能 [J], 徐雯;李晓;张卫英;英晓光3.L-酪氨酸印迹分子的制备及性能研究 [J], 雷孝;王锦;董新荣;何文礼;王超丽4.酪氨酸分子印迹电化学传感器的制备及性能 [J], 陈丹;连惠婷;孙向英;刘斌5.氯丙嗪分子印迹敏感膜传感器的制备与应用 [J], 刘蓉;钟桐生;龙立平;尹志芳;曹伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法
一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法脑卒中（Stroke）是一种常见的心血管疾病，严重影响患者的生活质量和寿命。
脑卒中发生时，大脑供血不足导致神经细胞死亡，因此早期的脑卒中诊断对预防不可逆性神经损伤至关重要。
脑卒中标志物的检测是脑卒中早期诊断的关键环节之一。
本文将介绍一种基于免疫传感的脑卒中标志物传感器的制备方法和检测方法。
首先，我们需要选取适当的脑卒中标志物作为传感器的检测目标。
目前，常用的脑卒中标志物有神经元特异性烯醇酸结合蛋白（Neuron-Specific Enolase，NSE）、轻链神经蛋白（Light Chain Neurofilament Protein，NFL）和肌钙蛋白I（Cardiac Troponin I，cTnI）等。
这些标志物在脑卒中发生后会在血液中明显升高，因此可用于早期脑卒中的诊断。
接下来，我们需要制备脑卒中标志物免疫传感器。
传感器通常包括两个主要组成部分：生物识别分子和传感器底物。
在本例中，我们选择脑卒中标志物的抗体作为生物识别分子，将其固定在传感器表面。
传感器底物可以选择金属纳米颗粒、有机小分子或蛋白质等。
其中，金属纳米颗粒具有较好的传感性能，可用于增强传感器的灵敏度。
制备脑卒中标志物免疫传感器的步骤如下：1.表面修饰：将传感器表面进行修饰，提高抗体的固定效果。
常用的修饰方法有硫化、羧基化和胺基化等。
例如，可采用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）修饰表面，增加荧光染料与表面的相互作用。
2.抗体固定：将脑卒中标志物的抗体与修饰后的传感器表面相互结合。
可以通过共价键、离子键或范德华力等方式进行固定。
例如，将胺基修饰的抗体与羧基化的表面进行偶联，形成稳定的连接。
3.免疫传感器构建：将固定有脑卒中标志物抗体的传感器与金属纳米颗粒相结合，构建出脑卒中标志物免疫传感器。
金属纳米颗粒的添加可以提高传感器的灵敏度和稳定性。
完成免疫传感器的制备后，我们可以进行脑卒中标志物的检测。
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DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.00258基于酪胺信号放大的新型免疫传感器刘梦琴*1 蒋健晖2 冯泳兰1 黄勇2 沈国励2 俞汝勤21(衡阳师范学院化学与材料科学系功能金属有机材料湖南省重点实验室,衡阳421008)2(湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室,长沙410082)摘 要 将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。
利用纳米金的静电吸咐和己二硫醇、巯基乙胺的自组装,将羊抗人Ig G 抗体固定到金电极表面上,以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG 抗体为酶标抗体,以生物素化酪胺为酶底物,利用催化酪胺沉积反应,在传感界面沉积大量生物素,使原始信号得到几何级数的放大。
结果表明,通过生物素化酪胺催化放大后,制得的免疫传感器对H 2O 2的催化能力增大近20倍,检测hIgG 在1.5 g /L ~22m g /L 范围内有良好的线性关系,检出限为0.1 g /L 。
用于实际试样的回收率的测定,结果良好。
关键词 电化学酶联免疫传感器;信号放大;酪胺氧化沉积;生物素;纳米金2009 06 22收稿;2009 10 08接受本文系国家自然科学基金项目(No .20205005)、新世纪优秀人才支持计划基金(N o .NCET 04 0768)、湖南省重点学科建设项目和湖南省教育厅科研计划项目(N o .07C162)资助*E m ai:l li um engqi n2004@yahoo .co 1 引 言酶联免疫分析法是将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的专一性、特异性相结合,以酶标记的抗原或抗体为主要试剂的免疫测试方法,具有很高的灵敏度和选择性[1~4]。
近年来,关于信号放大酶联免疫传感器的研究多采用安培型或伏安型免疫传感器[5~7]。
本研究将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。
酪胺,又名对羟基苯乙胺,是一类含氮低分子的生物胺,对动植物和微生物有重要的生理作用,具有易发生氧化的特性[8,9]。
酪胺信号放大的主要原理是将酪胺盐(Tyra m ine)交联上生物素,利用辣根过氧化物酶(HRP)在H 2O 2存在下催化酪胺盐,形成共价键结合位点,将大量的生物素沉积在要放大的信号位点上。
当滴加亲和素化的HRP(Av idi n HRP)复合物时,因在信号上存在许多生物素,大量H RP 沉积在信号周围,使原始信号得到几何级的放大。
生物素为小分子化合物,分子量244。
亲和素与生物素有极高的亲和力,结合牢固,而且特异性高,每个亲和素可结合4个生物素,用小分子生物素与HRP 酶标记的亲和素发生特异性反应,可减小抗原抗体反应的空间位阻,使反应明显放大。
近年来,利用纳米粒子的高比表面积和对电活性物质的催化特性,将纳米粒子引入电化学免疫传感器的研究已引起了人们的关注[10,11]。
金纳米粒子有着很好的电子传导和化学稳定等特性,可以强烈地吸附蛋白质抗体。
纳米金还能降低一些物质在电极上发生反应的氧化还原的电位,并催化这些物质在电极上的电化学氧化还原反应,广泛应用于分析和化学传感领域[12~14]。
本研究利用纳米金的静电作用和己二硫醇、巯基乙胺的自组装,将羊抗人I gG 抗体固定到金电极表面上,以辣根过氧化物酶标记羊抗人I gG 抗体为酶标抗体,将生物素化酪胺、亲和素化的H RP 酶信号放大引入反应体系,用夹心法进行hI gG 抗原测定,灵敏度明显提高。
2 实验部分2.1 仪器与试剂C H I 760B 电化学工作站(美国C H I 公司);三电极工作体系:工作电极为金电极( =1mm ),对电极为铂电极,参比电极为饱和甘汞电极(SCE );pH S 3C 型精密酸度计(上海雷磁仪器厂);78 1型磁力加热搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)。
用超高速离心机(Beck m an)浓缩胶体金溶液。
第38卷2010年2月 分析化学(FENX I HUAXU E) 研究简报Ch i nese Journa l o f A na l y tica l Che m i stry 第2期258~262h I gG 抗原、羊抗人I gG 抗体、HRP 标记羊抗人Ig G 抗体、HRP 标记的亲和素(北京中杉金桥生物技术公司);牛血清白蛋白(BSA,中国医药公司北京采购供应站);血浆蛋白成分参考血清(上海生物制品研究所);生物素 N 羟基丁二酸亚胺酯(BNH S)、酪胺、己二巯醇、巯基乙胺(Sig m a 公司);N,N 二甲基甲酰胺(DMF)、对苯二酚(西安化学试剂厂);戊二醛(上海化学试剂公司);氯金酸(上海生化试剂厂)。
0.01m o l/L PBS 缓冲液(p H 7.40),所有水溶液均以二次蒸馏水配制。
2.2 胶体纳米金的制备所有用于纳米金制备的玻璃仪器及聚四氟乙烯搅拌棒均用新制王水清洗,再用水冲洗后烘干备用。
参照文献[15]制备胶体金:在500m L 三口烧瓶中加入250mL 水,再加入2.5mL 1%HAuC l 4,在电炉上加热至沸腾后,快速加入4.4mL 1%柠檬酸钠。
溶液在2~3m in 内其颜色由淡黄色 蓝色 酒红色逐渐变化,然后继续保持沸10~15m i n ,移走热源,在室温下继续搅拌至冷却,定容至200mL,置4 冰箱冷藏备用。
用该法制得的纳米金颗粒的直径约为13n m 。
吸咐固定抗体时,可将纳米金胶体溶液先在室温下用30000r/m i n 转速浓缩30m in 。
将上层的微显紫罗兰红的液体弃去,便得到了浓缩后的纳米金胶体溶液。
2.3 免疫传感器的制备2.3.1 金电极的预处理 先用直径1mm 金电极粗研磨材料(刚玉泥或金刚砂,粒度约0.3~1.0 m )研磨打平,再用细研磨材料(粒度约0.05 m )抛光,使金电极表面光滑平整。
再分别用无水乙醇和二次蒸馏水超声洗涤3次,约需15m i n 。
于0.5m o l/L H 2SO 4中金电极在-0.3~+1.0V 之间进行循环伏安法扫描5圈。
洁净的金电极保存于浓H 2SO 4(p H 7.40PBS)中,使用前用二次蒸馏水冲洗干净。
2.3.2 金电极的修饰与固定 在洁净的金电极上滴加2.5mm o l/L 己二硫醇20 L ,室温培育1h 。
在自组装好己二硫醇的电极上滴加已浓缩的纳米金50 L ,置于4 的冰箱中培育3h ,电极表面略呈红色,再在室温下用10mmo l/L 巯基乙胺自组装1h 。
用2.5%戊二醛活化胺基,将羊抗人I gG 固定到传感界面上,于37 水浴中培育1h 。
用酪胺和牛血清白蛋白(BSA )封闭后,在电极上滴加hIg G,于37 的水浴中培育1h 。
用夹心法将H RP 酶标记羊抗人I gG 固定到电极上,于37 水浴中培育1h 。
免疫电极制备过程的每步修饰后,均将电极置于PBS 溶液(pH 7.40)中清洗3次。
2.3.3 生物素化酪胺(B T)的催化放大 生物素化酪胺(B T)的制备参见文献[16]。
A 液:10m g BNH S 溶于0.5mL 已去水的DMF 中;B 液:1.37m g 酪胺溶于0.5mL 已去水的DMF 中;把B 液倒入A 液中,遮光、搅拌反应5h 后,将B T 复合物置于4 冰箱中保存(可保存8个月)。
移取0.5mL B T 复合物于0.5mL 0.0075%H 2O 2(含PBS)+BSA 中,制得5mm o l/L B T 复合物的H 2O 2溶液(C 液)。
在电极上滴加C 液50 L,室温培育1h 。
利用生物素与亲和素的特异性反应,在室温下,将亲和素化HRP 酶结合到电极上。
2.4 测定方法以对苯二酚(p PDP)作媒介体,H 2O 2为底物,用循环伏安法测定HRP 酶催化H 2O 2的电流变化值。
3 结果与讨论3.1 循环伏安实验通过己二硫醇的自组装,先将纳米金吸咐到电极表面上,利用巯基乙胺的自组装与戊二醛交联法固定抗体,再加入HRP 酶标抗体,以夹心法进行酶联免疫反应测定。
基于HRP 酶催化H 2O 2氧化酪胺,将生物素化酪胺沉积到电极上,再利用亲和素化HRP 酶与生物素的结合,进行催化放大反应。
免疫电极制备过程的每步修饰后,均将电极置于5mmo l/L K 3Fe(C N )6/K 4Fe(CN )6(1 1,V /V )溶液中,在-0.2~+0.6V 之间进行循环伏安法扫描,扫速为100mV /s 。
由图1可见,裸金电极有一对明显的可逆氧化还原峰,用己二硫醇修饰后,氧化还原电流迅速减少,表明己二硫醇自组装单层形成,阻止了电活性探针的电化学反应。
稳定Au S 键,有利于纳米金的吸咐。
由图2可见,电极表面固定抗体、抗原及酶标抗体后,电流强度逐渐降低。
这是由于蛋白质修饰到电极表面后,对电子传递起阻碍作用,从而导致K 3Fe(CN)6/K 4Fe(CN )6在电极上的氧化还原电流随着259第2期刘梦琴等:基于酪胺信号放大的新型免疫传感器蛋白质修饰层数的增加而减小。
图1 修饰金电极的循环伏安图F i g .1 Cyc lic vo lta mm ogra m s o f mod ified go l d e l ec trodeCyclic volta mm ogra m sol u tion :5mm ol/L K 3Fe (CN )6/K 4Fe(CN)6(1 1,V /V ).Poten tial scann i ng range :-0 2~+0 6V ;S cann i ng rat e :100mV /s ; 1.Bare go l d el ectrode ;2.C ystei n e fil m ;3.Gol d nanoparti cles m od ifi ed el ectrode ;4.1,6 H exaned it h i o lm odifi eed el ectrode. 图2 酶联免疫反应的循环伏安图F i g .2 Cyc lic vo lta mmog rams o f enzym e li nked i m muno re action C ycli c volt a mm ogra m sol uti on:5mm ol/L K 3Fe (CN )6/K 4Fe(CN )6(1 1,V /V );Poten ti a l scann i ng range :-0.2~+0 6V;Scann i ng rate :100mV /s ;1.B i oti n t yra m i n e(B T )specifi c reaction ; 2.G oat An ti hum an Ig G e m bedded electrod e ;3.An tibody an tigen reacti on;4.I mm ob ili zati on of en z ym e labeled an ti body by sandw i ch m et h od ;5.Tyra m i ne cat alyz ed depositi ng en l arge m ent .3.2 催化信号放大以对苯二酚(p PDP)为媒介体,H 2O 2为底物,用循环伏安法测定催化信号放大前后(加入B T 前后)H RP 酶催化H 2O 2的电流变化值( i p ),见图3。